响应面法优化发酵棉籽粕生产菌种液态发酵工艺的研究

■姚 峻 马贵军 刘建成 蒋粒薪

(新疆天康畜牧生物技术股份有限公司生物添加剂分公司，新疆乌鲁木齐 830011)

棉籽粕是棉籽榨油后的副产品，其产量仅次于大豆粕。中国是个产棉大国，棉籽年产量达到1 100万吨以上，棉籽粕年产量达到600万吨以上。棉籽粕的粗蛋白含量可达34%～50%，但棉籽粕中含有大量的有毒物质游离棉酚，很大程度限制了棉籽粕在饲料生产中的应用。因此，如何大幅降低棉籽粕中游离棉酚的含量，是提高棉籽粕在生产中应用量的关键因素。国内外专家在如何降低游离棉酚含量的方法上进行过多种尝试，如物理法、化学法、复合或多次溶剂浸提和微生物发酵法等。目前，针对微生物固态发酵降酚的研究主要集中在高效降酚菌种的选育、发酵底物成分组合的优化、发酵原料与发酵产物营养成分变化的研究，但对固态发酵所需的液体菌种发酵工艺研究较少，因此本试验以枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌复合菌种液态发酵工艺为研究对象，采用响应面分析法对复合菌种液态发酵条件进行了优化，最终确定了得到最大细菌总数的发酵条件，提升了生产效率。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌种

枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司动物营养中心提供。

1.1.2 试验培养基

枯草芽孢杆菌培养基：牛肉膏1.0 g/l、氯化钠0.5 g/l、蛋白胨1.0 g/l、琼脂15.0 g/l，pH值7.2，121～126℃灭菌30 min。乳酸菌培养基：牛肉膏10.0 g/l、蛋白胨10.0 g/l、酵母浸膏5.0 g/l、葡萄糖5.0 g/l、磷酸氢二钾 2.0 g/l、乙酸钠 5.0 g/l、硫酸镁 0.2 g/l、柠檬酸铵 2.0 g/l、硫酸锰 0.05 g/l、吐温80 1.0 g/l、琼脂20.0 g/l，pH值6.8，121～126 ℃灭菌30 min。酵母菌培养基：麦芽浸粉1.0 g/l、葡萄糖1.0 g/l、琼脂20.0 g/l，在121～126 ℃灭菌30 min。复合菌培养基：糖蜜40.0 g/l、蛋白胨10.0 g/l、葡萄糖1.0 g/l、硫酸镁0.2 g/l、磷酸氢二钾0.5 g/l，121～126 ℃灭菌30 min。

1.2 试验方法

1.2.1 复合菌种液态发酵液的制备

用灭过菌的移液枪吸取无菌水1 ml，将附着在斜面上的各菌落洗下，并接种于装有50 ml复合培养基的250 ml三角瓶中，放入智能生化培养箱中静置培养，按试验设计控制发酵温度、发酵时间及发酵液的初始pH值。

到达发酵终点时，进行细菌总数的测定。

1.2.2 发酵液中各指标测定方法

pH值的测定：使用雷磁pH仪测定；

细菌总数的测定：饲用细菌总数的测定参照GB13093—91的方法进行。

2 结果与讨论

2.1 影响发酵液细菌总数的单因素试验

2.1.1 发酵温度对细菌总数的影响

发酵时间48 h，pH值7.0时，不同发酵温度对细菌总数的影响见图1，随着发酵温度的升高，10～20℃对细菌总数的影响不大，20～40℃细菌总数有明显的上升趋势，40～50℃细菌总数有着急剧下降的趋势，说明复合菌种的生长对外界温度的变化很敏感，35～45℃出现明显的峰值，说明复合菌种在此温度区间繁殖较快，适合菌种的生长。

图1 发酵温度对细菌总数的影响

2.1.2 发酵时间对细菌总数的影响

发酵温度40℃，pH值7.0时，不同发酵时间对细菌总数的影响见图2，随着发酵时间的延长，0～24 h细菌总数上升的比较缓慢，说明细菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂适应过程，24～36 h细菌总数直线上升，说明大部分菌种处于对数生长期，48～72 h细菌总数缓慢下降，说明细菌繁殖越来越慢，死亡菌数明显增多，36～48 h出现峰值，说明此区间菌种的繁殖非常旺盛。

图2 发酵时间对细菌总数的影响

2.1.3 pH值对细菌总数的影响

发酵温度40℃，发酵时间48 h时，不同pH值对细菌总数的影响见图3，随着pH的升高，pH值3～4细菌总数很低，说明此复合菌种的耐酸能力不强，pH值4～7细菌总数有着明显的升高，pH值7～8细菌总数有所下降，pH值7.0左右出现峰值，说明复合菌种的最适生长pH值接近中性，过酸或过碱都不利于菌种的生长。

图3 pH值对细菌总数的影响

2.2 响应面法对棉籽粕生产菌种液态发酵工艺的优化

根据单因素实验的结果，确定了Box-Behnken设计的自变量，以细菌总数为应变量，运用Minitab15软件进行响应曲面分析(response surface analysis)，对发酵条件进行优化，响应面设计因素水平设计见表1。

表1 响应面设计因素水平

对试验数据进行多项式拟合回归运算，得到以细菌总数(Y)为因变量，发酵温度(X1)、发酵时间(X2)和pH值(X3)为自变量的回归方程如下：

对回归方程进行方差分析,结果见表3。细菌总数与试验3个因素的回归方程的F值为76.78,说明方程显著。回归方程的现行相关系数为99.34，说明3个自变量与应变量之间的线性关系显著。

表2 响应面分析试验结果

表3 回归方程各项的方差分析

从表3中可以看出，方程一次项、二次项P值均小于0.01，说明两项的影响都是显著的。交互项P值大于0.01，说明交互项作用影响不显著，故计算时交互项可以省略，同时可以看出，各自变量对应变量的影响不是简单的线性关系。

图4～图6明显的反映了各自变量的变化对响应值的影响。将三组图进行比较可知，发酵温度较发酵时间、pH值对细菌总数的影响更为显著。

2.3 验证试验

对Minitab15数据处理软件分析得到的回归方程求导数，即可得到3个方程：

将方程组式(1)、式(2)、式(3)联立解得X1=-0.079、X2=0.259、X3=0.057,即棉籽粕生产菌种液态发酵最优条件为：发酵温度为39.21℃、发酵时间为39.11 h和pH值7.06，由回归方程可以确定细菌的最大总数为284.46×106cfu/ml。为了验证结果的可靠性，将计算得到的棉籽粕生产菌种液态发酵最优条件进行三组平行试验，结果得出，细菌的实际平均总数为283.0×106cfu/ml。与理论预测值基本相符，平均误差为0.52%。因此，利用响应面分析法得到的发酵棉籽粕生产菌种最佳发酵条件真实可靠，能够提高生产效率，具有实际意义。

图4 发酵温度(X1)与发酵时间(X2)对细菌总数的影响

图5 发酵温度(X1)与pH值(X3)对细菌总数的影响

图6 发酵时间(X2)与pH值(X3)对细菌总数的影响

3 结论

采用响应面分析法优化发酵棉籽粕生产菌发酵工艺，从试验结果中可以看出，当发酵温度为39.21℃、发酵时间为39.11 h和pH值为7.06时，细菌总数最大为283.0×106cfu/ml，与预期值相符。

（参考文献若干篇，刊略，需者可函索）