ALOX5AP、COX2和MMP9基因多态性与缺血性脑卒中相关性

李健业,吴海容,李海先,侯树刚,孙瑛,周畅,张晨

(青岛大学医学院附属医院神经内科,山东青岛 266003)

·论著·

ALOX5AP、COX2和MMP9基因多态性与缺血性脑卒中相关性

李健业,吴海容,李海先,侯树刚,孙瑛,周畅,张晨

(青岛大学医学院附属医院神经内科,山东青岛 266003)

目的探讨5-脂氧合酶激活蛋白(ALOX5AP)、环氧化酶2(COX2)和基质金属蛋白酶9(MMP9)基因单个位点、单倍型及基因-基因间的相互作用与缺血性脑卒中(IS)的相关性。方法检测302例IS病人及308例健康查体者(对照组)ALOX5AP89G/A、COX2-765G/C、COX2-1195G/A以及MMP9-1562C/T的基因多态性,并对各基因位点及COX2基因两个位点的单倍型进行分析。用广义多因子降维(GMDR)方法检测基因与基因之间的相互作用。结果COX2-765GC基因型和COX2-1195GA基因型均与IS的患病风险相关(校正后OR＝2.650、1.565),COX2-765C等位基因和COX2-1195G等位基因增加IS患病风险(OR＝2.142、1.344);IS组单倍型C-765A-1195和G-765G-1195较对照组高(OR＝1.872、1.289),而单倍型G-765A-1195较对照组低(OR＝0.649);IS组和对照组ALOX5AP89G/A和MMP9-1562C/T位点等位基因、基因型的频率差异均无显著性(P＞0.05)。GMDR检测显示,COX2基因和MMP9基因间相互作用有统计学意义,但多元Logistic回归没有进一步证实这种相互作用。结论汉族人群IS可能与COX2基因多态性有关,ALOX5AP基因和MMP9基因多态性与IS可能无关;IS病人COX2基因和MMP9基因间可能没有相互作用。

5-脂氧合酶激活蛋白;环氧化酶2;明胶酶B;脑血管意外;遗传;多态性,单核苷酸

脑卒中是我国人口疾病死亡的主要原因之一,由动脉粥样硬化导致的缺血性脑卒中(IS)是其最常见的类型。炎症是动脉粥样硬化的一个关键性致病机制,通过促进粥样斑块的形成、不稳定斑块的发展及斑块破裂,最终导致脑卒中[1]。该过程涉及多个危险因子,血浆基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、5-脂氧合酶激活蛋白(ALOX5AP)/5-脂氧合酶(5-LO)通路的产物白三烯B4、环氧化酶2(COX-2)/前列腺素E2(PGE2)通路的产物PGE2在动脉粥样硬化的发生发展中有重要作用。研究结果表明,MMP9基因、ALOX5AP基因及COX2基因参与、影响不同的炎症通路[2-3],其基因变异造成大量MMP9、白三烯B4及PGE2的产生,参与局部炎症反应、动脉粥样硬化形成及斑块破裂等病理过程,增加脑卒中的发病风险。IS是一种与遗传因素密切相关的多基因疾病。单基因对脑卒中患病风险的影响可能很小甚至检测不到,但是多种微效基因的相互作用可能会成为患病的主要诱因。基于以上机制,本研究将COX2、ALOX5AP和MMP9基因作为候选基因,探讨其单个位点、单倍型以及基因-基因间的相互作用与IS的关系。

1 对象和方法

1.1 研究对象

2011—2012年,选取在我科住院的IS病人302例,符合第四届全国脑血管病会议修订的诊断标准,经颅脑CT或MRI/MRA及颈部血管彩超确诊,并由两名神经科医师根据临床及各项检查结果进行TOAST分型(主要为大动脉粥样硬化型和小动脉闭塞型)。排除脑出血、蛛网膜下隙出血、心源性脑栓塞、颅内肿瘤和脑血管畸形所致脑梗死,以及重症全身性疾病如胶原病、内分泌代谢性疾病(糖尿病除外)、严重的心肝肾功能损害等病人。选取同期我院健康查体者308例作为对照组,经详细询问病史及体格检查,均无脑血管病史。所有受试者为汉族人群,均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 问卷调查、体格检查和实验室检查 由专业医务人员,对受检者进行心脑血管病问卷调查,身高、体质量及血压测定。采集受检者空腹12 h的外周静脉血,应用全自动生化分析仪检测血糖、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)及低密度脂蛋白(LDL)水平。

1.2.2 基因型判定 采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性方法,检测ALOX5AP89G/A、COX2-765G/C、COX2-1195G/A以及MMP9-1562C/T的基因多态性。根据各位点的已知序列及参考文献[4]设计引物并选择相应的限制性内切酶。DNA引物由上海生工生物工程有限公司合成;限制性内切酶购自NEB公司。PCR反应体系10μL,内含: DNA模板1.0μL,Taq Master Mix 5.0μL,上下游引物各0.2μL,缓冲液3.6μL。酶切反应体系为10μL,内含有:PCR产物3.0μL,限制性内切酶0.3μL,缓冲液1.0μL,灭菌双蒸水5.7μL。酶切产物用20 g/L琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像系统下观察酶切结果。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0软件对数据进行处理,计量资料结果用±s表示,数据间比较采用独立样本t检验;计数资料比较采用卡方检验[5]。多基因相互作用的统计分析采用广义多因子降维(GMDR)软件,连锁不平衡状态的分析应用Haploview软件,单倍型构建应用SHEsis软件。多元Logistic回归调整脑梗死传统危险因素的影响。

2 结 果

2.1 两组一般资料比较

IS组和对照组的年龄、性别、TG、TC、HDL、LDL、吸烟史、高血压史、糖尿病史差异有统计学意义(t＝2.253～9.587,χ2＝27.638～119.484,P＜0.05),体质量指数(BMI)差异无显著性(P＞0.05)。见表1。

2.2 各基因型及等位基因分布与关联分析

IS组和对照组中各位点的基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡。多元Logistic回归分析显示,校正年龄、性别、吸烟、高血压、糖尿病、高脂血症等危险因素以后,COX2-765GC基因型的人群IS患病风险是COX2-765GG基因型的2.650倍(校正后的OR＝2.650,95%CI＝1.434～4.895,P＜0.01),而COX2-1195GA基因型的人群其IS患病风险是COX2-1195AA基因型的1.565倍(校正后OR＝1.565,95%CI＝1.010～2.425,P＜0.05);COX2-765C等位基因的人群IS患病风险是COX2-765G等位基因的2.142倍(OR＝2.142,95%CI＝1.330～3.449,P＜0.01),COX2-1195G等位基因的人群IS患病风险是COX2-1195A等位基因的1.344倍(OR＝1.344,95%CI＝1.071～1.686,P＜0.01);IS组和对照组ALOX5AP89G/A和MMP9-1562C/T位点的基因型及等位基因频率比较,差异均无显著性(P＞0.05)。见表2。

2.3 连锁不平衡和单倍型分析

应用Haploview软件分析显示,COX-2基因两多态位点完全连锁不平衡(D’＝1,r2＝0.075)。应用SHEsis软件构建单倍型,见表3。IS组单倍型G-765G-1195及C-765A-1195均高于对照组,差异有统计学意义(χ2＝4.803、6.572,OR＝1.289、1.872,95% CI＝1.027～3.044,P＜0.05);而单倍型G-765A-1195则低于对照组,差异有统计学意义(χ2＝14.151, OR＝0.649,95%CI＝0.518～0.813,P＜0.01)。

2.4 基因-基因相互作用的分析

将ALOX5AP基因、COX2基因和MMP9基因各位点的基因型纳入GMDR模型,各等级最佳相互作用模型见表4。包含ABD的三阶最佳模型对IS有统计学意义(P＝0.010 7,CV＝10)。为进一步解释GMDR最佳模型的统计学意义,用多元Logistic回归分析该模型,以分类变量IS组和对照组为因变量,以COX2基因型、MMP9基因型为自变量进行分析,采用进入法进行回归分析。经校正年龄、性别、高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟等因素后,COX2基因型与MMP9基因型间的相互作用无统计学意义(OR＝0.827,95%CI＝0.544～1.258,P＞0.05)。

表1 IS组与对照组一般资料比较(±s)

组别n年龄(岁)____男性(χ/%)__ BMI (kg/m2)_ TG(c/ mmol·L－1) TC(c/ mmol·L－1) HDL(c/ mmol·L－1) LDL(c/ mmol·L－1)吸烟史(χ/%)_高血压史(χ/%)__糖尿病史(χ/%)对照组308 63.21±8.19 45.3 23.64±2.92 1.56±0.93 4.95±0.91 1.42±0.35 2.59±0.75 23.4 26.3 16.2 IS_组_302 65.71±9.88__54.7__24.07±2.79_1.74±0.95__4.67±1.15__1.27±0.32__2.74±0.81 46.7 70.5 34.8

3 讨 论

目前认为,复杂疾病的影响因素分为两类:一是异质性相关因子,二是相互作用相关因子[6]。前者包括位点异质性、等位基因异质性等;后者包括基因-基因相互作用和基因-环境相互作用。这些影响因素中的一个或者多个,无论是简单的叠加,还是网络性的相互作用,均造成复杂疾病的复杂性。属于复杂疾病的脑卒中受到的遗传因素的影响亦是多基因模式的。

COX2是花生四烯酸合成前列腺素类物质的主要限速酶,COX2及前列腺素可导致血管壁的炎症反应、斑块的不稳定及内膜增生。COX2基因编码COX2,后者可以诱导PGE2高表达,进而触发动脉粥样硬化内膜中PGE2依赖的MMP9的表达,促进粥样斑块进入不稳定状态。本文研究结果显示, COX2-765GC基因型、COX2-1195-GA基因型以及COX2-765C等位基因和COX2-1195G等位基因是IS的危险因素,单倍型C-765A-1195和G-765G-1195亦是IS的危险因素,而G-765A-1195单倍型则是IS的保护因素。这与之前的一些研究结果相似[7-8],提示COX2基因与IS具有相关性。

ALOX5AP/5-LO通路是白三烯代谢的重要中间环节。ALOX5AP可与花生四烯酸结合后激活5-LO,进一步调节白三烯的产生,而白三烯是典型的促炎因子,可激活白细胞、增加血管通透性以及启动和加速动脉粥样硬化病理过程等[9]。研究表明, ALOX5AP基因的单倍型Hap A可使冰岛人群的脑卒中风险增加1.67倍[10],该基因变异可造成大量白三烯的产生和炎症递质的分泌,参与血管炎症和动脉粥样硬化的发生发展[3]。MMP9属于明胶酶,主要通过降解Ⅳ、Ⅴ型胶原,破坏细胞外基质和基底膜,造成血管损伤,同时降解纤维帽内胶原纤维致纤维帽变薄,易于形成不稳定斑块。已有研究证实,MMP9-1562C/T基因多态性与动脉粥样硬化性疾病相关,该位点C向T的转换导致基因转录活性增加,参与了动脉粥样硬化的细胞外基质降解、炎症细胞浸润、斑块破裂等病理过程[2]。然而本研究并未显示ALOX5AP89G/A和MMP9-1562C/T基因多态性与IS相关。

脑卒中是一种多基因参与、多危险因素的复杂疾病,单个易感基因对表型的影响较小(OR＝1.2～1.5)[11],多个不同的基因参与影响不同的通路,最终导致脑卒中发生。一项对中国人群的研究结果显示,Notch3、MTHFR和ALOX5AP基因的相互作用可以显著增加血栓性脑卒中的患病风险(OR＝3.72)[12]。本文研究采用GMDR方法检测到COX2基因和MMP9基因间存在相互作用,但这种相互作用应用多元Logistic回归研究未得到证实,故我们认为IS病人COX2基因和MMP9基因可能无相互作用。

本研究也存在着一些不足之处:①样本量较小,也许不具有人群代表性,统计学效能的不足可能导致阴性结果,因此需要在更大样本量的病例对照人群中进一步研究;②只检测了候选基因上的一个或两个位点,这些位点可能无法覆盖整个基因的连锁不平衡信号,因此有必要构建各基因的连锁不平衡图,以明确各基因与IS发病的关系;③由于遗传的异质性和表型的异质性,不同地区和不同种族人群对同一疾病的易感性不同,因此还需要在不同地区、不同种族人群中进行验证。

总之,本研究表明COX2基因的两个多态位点及其构建的单倍型均与IS发病存在一定关联性,目前尚不明确COX2基因和MMP9基因间相互作用与IS是否有关。该研究对于阐明IS的遗传机制,探索IS患病风险预测、开发药物治疗新靶点等方面具有一定参考价值。

[1]ROSS R.Atheroselerosis——an inflammatory disease[J].The New England Journal of Medicine,1999,340(2):115-126.

[2]BLANKENBERG S,RUPPRECHT H J,POIRIER O,et al.Plasma concentrations and genetic variation of matrix metalloproteinase 9 and prognosis of patients with cardiovascular disease[J].Circulation,2003,107(12):1579-1585.

[3]KAJIMOTO K,SHIOJI K,ISHIDA C,et al.Validation of the association between the gene encoding 5-lipoxygenase-activating protein and myocardial infarction in a Japanese population[J].Circulation Journal:Official Journal of the Japanese Circulation Society,2005,69(9):1029-1034.

[4]GAI X B,LAN X P,LUO Z R,et al.Association of MMP-9 gene polymorphisms with atrial fibrillation in hypertensive heart disease patients[J].Clinica Chimica Acta,2009,408(1/ 2):105-109.

[5]殷蓓蓓,梁军,谷建.晚期结直肠癌GSTP1基因多态性与奥沙利铂化疗效果关系[J].齐鲁医学杂志,2009,24(3):192-194.

[6]THORNTON-WELLS T A,MOORE J H,HAINESJ L.Genetics,statistics and human disease:analytical retooling for complexity[J].Trends in Genetics:TIG,2004,20(12):640-647.

[7]COLAIZZO D,FOFI L,TISCIA G,et al.The COX-2 G/C-765 polymorphism may modulate the occurrence of cerebrovascular ischemia[J].Blood Coagulation&Fibrinolysis,2006,17 (2):93-96.

[8]MOONS L M,KUIPERS E J,RYGIEL A M,et al.COX-2 CA-haplotype is a risk factor for the development of esophageal adenocarcinoma[J].The American Journal of Gastroenterology,2007,102(11):2373-2379.

[9]孙蕾,李聪,宋博,等.ALOX5AP基因多态性与缺血性脑卒中的相关性[J].青岛大学医学院学报,2012,48(3):207-210.

[10]HELGADOTTIR A,MANOLESCU A,THORLEIFSSON G,et al.The gene encoding 5-lipoxygenase activating protein confers risk of myocardial infarction and stroke[J].Nature Genetics,2004,36(3):233-239.

[11]MANOLIO T A,COLLINS F S,COX N J,et al.Finding the missing heritability of complex diseases[J].Nature,2009,461 (7265):747-753.

[12]LIU J H,SUN K,BAI Y Y,et al.Association of three-gene interaction among MTHFR,ALOX5AP and NOTCH3 with thrombotic stroke:a multicenter case-control study[J].Human Genetics,2009,125(5/6):649-656.

(本文编辑 黄建乡)

ASSOCIATION BETWEEN GENE POLYMORPHISM OF ALOX5AP,COX2,MMP9 AND ISCHEMIC STROKE

LI Jianye,WU Hairong,LI Haixian,HOU Shugang,SUN Ying,ZHOU Chang,ZHANG Chen (Department of Neurology,The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003,China)

ObjectiveTo explore whether genetic variants in the ALOX5AP gene,COX2 gene and MMP9 gene would synergistically influence the risk of ischemic stroke(IS).MethodsVariants of ALOX5AP89G/A,COX2-765G/C,COX2-1195G/A and MMP9-1562C/T in 302 IS patients and 308 healthy controls were detected,and the polymorphisms studied.By using GMDR,the interaction among genes was measured.ResultsCOX2-765GC genotype(adjusted OR＝2.650)and COX2-1195GA genotype(adjusted OR＝1.565)were associated with the risk of IS.In IS group,C-765A-1195and G-765G-1195were higher than that in the control(OR＝1.872,1.289),while G-765A-1195was lower(OR＝0.649);The differences of ALOX5AP89G/A and MMP9-1562C/T allele,and genotype frequency between ISand control group were not significant(P＞0.05).The GMDR analysis showed a statistically significant gene interaction between COX2 and MMP9,but which was not confirmed by Logistic regression analysis.ConclusionIn Han people,IS may associate with genetic polymorphism of COX2,and not with ALOX5AP and MMP9.There is probably no interaction of COX2 and MMP9 in IS.

ALOX5AP;cyclooxygenase 2;gelatinase B;cerebrovascular accident;heredity;polymorphism,single nucleotide

R743

A

1008-0341(2013)04-0321-04

10.11712/qlyx201304013

2012-12-03;

2013-03-07

山东省自然科学基金资助项目(ZR2010HM061)

李健业(1985-),男,在读硕士研究生。

张晨(1957-),男,教授,博士生导师。