寄生虫耐药性检测方法研究进展

徐倩倩, 郭时金, 沈志强

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600；2.山东绿都安特动物药业有限公司，山东 滨州 256600))

寄生虫耐药性，一般指寄生虫与药物多次接触后，对药物的敏感性下降甚至消失，致使药物对抗药寄生虫的疗效降低或无效。目前，驱虫药主要有苯并咪唑类、咪唑并噻唑类和大环内酯类三大类，寄生虫对三类药物的耐药现象均已有报道。抗药性的出现直接影响着寄生虫病的治疗效果，并给寄生虫病的控制带来困难，及时发现和控制寄生虫耐药是保证药物有效性的基础[1]。现已建立的体内外寄生虫耐药性检测方法有粪便虫卵计数、对照试验、虫卵孵化分析、幼虫麻痹、移行和活力测试、幼虫发育试验、静止期幼虫形态分析、幼虫采食抑制试验、成虫发育试验、生化试验和分子技术的应用等，但每种方法在可信性、重复性、敏感性和适用性等方面都存在一些缺陷。本文对每种方法进行了分析，为抗寄生虫药物耐药性的研究和耐药虫株的监测提供参考。

1 寄生虫耐药性体内检测方法

1.1 粪便虫卵计数

粪便虫卵计数(Faecal egg reduction, FECRT)是通过计数用药前后粪便中虫卵数来评价耐药性[2-3]。该方法只能推测雌性成虫排卵数，不能完全反映虫体数，所以不能准确反映驱虫药的效果。粪便虫卵计数受寄生虫类型、寄主类型、耐药药物、检测时间等因素影响较大[4-6]。如该方法对捻转血矛线虫检测较为有效，而在普通奥斯脱他线虫、蛇形毛圆线虫和细颈线虫检测时，相关性较差；山羊粪便虫卵数一般较高，但与载虫数相关性不好；伊维菌素治疗普通奥斯脱他线虫时，给药后10～14 d排卵才被完全抑制，过早检测可能会出现假阴性结果[7]，而在左咪唑耐药评价时，如果给药后10 d进行检测，则可能会出现假阳性结果，而应在给药后7 d检测。

进行粪便虫卵计数时，选择寄生虫感染阳性动物数不应少于10头；虫卵计数时，一般选用算术平均数进行计算；不同实验室之间数据的转换可能也不同，这给数据的比较也带来了困难。

单独应用FECRT并不能提供准确的结果，可借助幼虫孵育确定虫体种类，但不同种属幼虫孵育所需条件也有差别，从而导致虫体种类确定的困难。另外，当耐药虫株比例小于25%时，该方法就失去了效用[8]。有学者对该方法进行了改良，可以用于田间检测[6]。虽然FECRT存在众多缺点，但一直作为寄生虫耐药性检测的经典方法[9-10]，或者作为新检测方法的对照使用[11-12]。

1.2 对照试验

对照试验是评价耐药性最有效，也是最费力、使用动物最多、最费时的试验[13]，目前已极少应用。为了减少花费、缩短试验周期，多采用动物模型。该方法是用感染性虫卵攻毒无寄生虫感染动物，用推荐剂量的0.5、1、2倍驱虫，如果虫体平均下降率低于90%，或剖检动物体内仍有1000条虫体，则说明耐药已产生。

2 寄生虫耐药性体外检测方法

2.1 虫卵孵化分析

虫卵孵化分析(Egg hatch assays, EHAs)源于苯并咪唑类驱虫药抑制虫卵受精及孵化，可以定性、定量评价药物对虫体Ⅰ期或Ⅲ期幼虫的作用，该方法适用于水溶性较好的驱虫药。在不同浓度的驱虫药中孵育幼虫，计算一段时间后每个浓度下虫卵的孵化率(或死亡率)，不加药物组进行对照，描绘剂量-效应曲线，对数据进行对数处理后做线性回归，得出ED50(虫卵半数死亡的药物浓度)。Boersema等[2]用该方法评价苯并咪唑对敏感和耐药线虫卵受精和发育的影响，发现其所需浓度不同，捻转血矛线虫敏感和耐药虫株的ED50也不同。但也有学者怀疑该方法的准确性，因为该方法受寄生虫年龄和宿主感染程度影响[14-15]。与FECRT相同，当耐药虫株比例小于25%时，EHAs就失去了意义[16]。

EHAs试验需未发育虫卵，限制了其使用范围，因为采用已发育的虫卵可能会导致假阳性结果。因此，检测苯并咪唑类药物耐药时，用饱和糖水法收集虫卵，用绝缘材料密封保存以防运输途中虫卵发育；或者将新鲜粪便放在4 ℃环境中，可保存3 d，无氧环境可保存7 d。该方法成功检测了细颈线虫和寄生虫对左咪唑的耐药。目前，EHAs被许多反复验证、优化和试验过程的标准化[17]，用于自然感染线虫的耐药性检测时取得了与实验室一致的结果[18]。

2.2 幼虫麻痹、移行和活力测试

幼虫麻痹试验主要用来检测左咪唑和甲噻嘧啶的耐药性。试验中，感染性Ⅲ期幼虫与不同浓度的驱虫药作用24 h，计数不同浓度下麻痹幼虫数目，做剂量-效应曲线，并与已知参考虫株比较。该方法必须选用合适发育阶段的幼虫，否则已麻痹的幼虫存在复苏的可能，降低方法的重复性[19]。

Sutherlan等[20]在乙酰胆碱酯酶抑制剂毒扁豆碱存在的条件下检测噻苯咪唑耐药，结果发现耐药幼虫产生麻痹比相应的敏感虫株要慢。后来研究者发明了一种微活力测试器，应用微处理器测量半月板界面的光反射，用来检测线虫幼虫和成虫与药物作用后的活力改变[21-22]。溶液中幼虫的移行改变折射到光电二极管内的角度，通过检测光线偏移，将信号传入计算机系统，推算移动指数。用该仪器检测了捻转血矛线虫的体外耐药性：苯并咪唑耐药捻转血矛线虫对不同驱虫药的活力反应，并获得捻转血矛线虫幼虫在感染不同阶段对驱虫药的反应。结果发现苯并咪唑耐药和敏感虫株的活力有所不同，但对左咪唑耐药和敏感虫株却未发现区别[23]。

Gill等[24]用活力测试检测捻转血矛线虫Ⅲ期幼虫对伊维菌素的耐药性。Ⅲ期幼虫在含有不同浓度伊维菌素的琼脂内，25 ℃避光孵育，一段时间后，用光刺激使其活动，结果发现药物浓度和幼虫活力之间有相关性，即伊维菌素引起的幼虫麻痹试验能够区分耐药和敏感分离株。

也有人用成虫移行试验检测猪齿状核结节线虫对噻嘧啶和苯并咪唑的耐药性[25]。先将成虫放入不同浓度的药液中培养30 min，再转移到移行装置，这种装置该有30～50 μm微孔聚酰胺网，移行30 min，按照不同浓度药物对移行的抑制做剂量-效应曲线。

2.3 幼虫发育试验

大多数驱虫药对寄生虫的代谢都有一定程度的作用，从而影响寄生虫的发育，为耐药检测提供了思路。学者将Ⅰ期幼虫(加热的冷冻干燥大肠杆菌作为饲料)放入不同浓度的试验药物，同时设有不加药物的对照组。这种方法可以区分苯并咪唑和左咪唑耐药和敏感捻转血矛线虫，几乎可以用于检测所有驱虫药的耐药，被认为是快速、可信、廉价并适于田间应用。同时，这种方法需要Ⅰ期幼虫，无需未发育的虫卵和新鲜粪便样品，给样品的采集带来了方便。后来这种方法被用于伊维菌素耐药性检测，用酵母提取物作为幼虫的饲料[26]。

虽然LDT(Larval development tests,LDT)不能给出剂量-效应关系推导LD50，但可用于UK的驱虫药耐药性调查。据报道，检测苯并咪唑和左咪唑耐药可信性较高，但伊维菌素耐药检测的效果较差[27]。后来对该方法进行了改进，例如将虫卵放入含有驱虫药的琼脂层中的微量板法，采用琼脂可以解决大环内酯类药物的溶解性问题，并可以测出伊维菌素的剂量-效应关系及LD50值。

Hubert等[28]采用Earle's平衡盐、酵母提取物和细菌作为基质，在5 mL导管中进行试验，测得了三类驱虫药的LD50值，这种方法测得的剂量-效应关系的线性良好。因为被测药物与幼虫有更大的接触面积，该方法在检测苯并咪唑和左咪唑耐药时效果很好，但检测阿维菌素类药物时需要伊维菌素以外的同系物做参照[27]。近年来，采用液体基质LDA检测牛线虫的伊维菌素耐药性取得了较好的结果[29]。伊维菌素敏感和耐药点状古柏线虫比较，耐药率为5.3[10]。

2.4 静止期幼虫形态分析

根据药物作用的机理，有的驱虫药作用于寄生虫的神经肌肉系统，因此引起幼虫形态的影响，通过幼虫与药物作用一段时间后的形态变化，评估药物对虫体的作用[30]。试验一般采用96孔细胞培养板，设置空白对照组(不加药物的溶媒对照)和不同浓度的试验药物组，每组设多个重复。微孔加入溶媒或不同浓度的药物后一定量 20 g/L融化的琼脂，将培养板在室温放置2 h平衡温度，然后向琼脂表面滴加30 μL幼虫混悬液(每毫升含有7000条幼虫的水溶液，含10 mL/L青-链霉素和100 mL/L两性霉素B)，每孔大约分布有200条幼虫。用封口膜封好，25 ℃孵育[31]。250倍显微观察不同作用时间三期幼虫形态的改变。幼虫没有扭结或仅在头部和尾部有轻微偏移的为“正常”，卷曲、扭结者为受药物影响虫体为“异常”，计数各组每个时间点的“正常”和“异常”虫体数，通过各组间比较评价药物对虫体的作用。Kopp等[32]用该方法评价了噻嘧啶对犬钩虫耐药和敏感虫株的体外作用，发现耐药和敏感虫株的LD50有显著差异，徐倩倩等[33]用该方法评价了米尔贝肟对犬钩虫的体外作用，表明米尔贝肟对犬钩虫形态有极大的影响。

2.5 幼虫采食抑制试验

Hawdon等[34]利用幼虫采食抑制试验评价犬钩虫的体外耐药情况。在96微孔细胞培养板进行，每孔加入100 μL采食激活液(激活液为含有15%犬血清和100 mM甲基谷胱甘肽的RPMI-C)。犬钩虫幼虫以3 000 rpm 离心10 min后加入到含有1%HCl的PBS中。37 ℃轻摇30 min后，再次离心，然后将幼虫移入RPMI-C，使幼虫含量为1 500个/mL。取含有幼虫的混悬液加入到微孔中，5% CO237 ℃孵育24 h，加入不同浓度的药物，然后每孔中加入100 μL荧光异硫氰酸酯结合牛血清白蛋白，继续孵育3 h。试验结束，将微孔中的幼虫转移到1.5 mL EP管中，用1.5 mL PBS清洗5次，每次3 000 rpm 离心3 min，之后将幼虫转移到平底96微孔细胞培养板中进行计数，然后在激发波长460 nm，光栅565 nm下荧光倒置显微镜观察荧光强度，只有50%的肠道有荧光的幼虫算入采食，比较药物处理组采食幼虫数占对照组采食幼虫数的比例[35-36]。Kopp等[32]将该方法成功用于犬钩虫对噻嘧啶的耐药研究。

2.6 成虫发育试验

体外培育毛圆线虫的技术已有报道[37]。如捻转血矛线虫已在体外培育到成虫，但因为成虫体外培养体系过于复杂，该方面的研究进展很小。

2.7 生化分析试验

苯并咪唑类药物耐药的机制是微管蛋白与驱虫药的结合力降低，基于该理论，Lacey等[38]通过氚标记了的苯并咪唑氨基甲酸酯与Ⅲ期幼虫提取的微管蛋白结合评价耐药性。这种方法快捷、耐用，重复性好，对寄生虫耐药情况的微小变化即有敏感反应，但需要幼虫数目过大，不适于田间分析。

苯并咪唑耐药与敏感毛圆线虫的非特异性酯酶和乙酰胆碱酯酶也用于生化分析，这种方法通过目测或光密度计的比色分析，耐药虫株的酯酶或乙酰胆碱酯酶的活性显著高于敏感株。

2.8 分子技术

从分子遗传学角度看，耐药的出现可能有以下几种原因：分子靶标的改变，药物不能识别靶标从而失效；代谢的改变，使药物失活、移除药物或阻止其活性；药物在靶组织分布的改变，阻止药物接触其作用位点；靶基因扩增超过药物作用[39]。主要抗寄生虫药物耐药性产生的机制大概如下：

(1)苯并咪唑类 β-微管蛋白同种型Ⅰ突变，其中F200Y，F167Y是最重要的。Roos等[40]在Southern blotting之后用RFLPs研究苯并咪唑耐药和敏感捻转血矛线虫的幼虫和成虫DNA多态性。捻转血矛线虫的克隆α-和β-微管蛋白用作探针分析感染性幼虫和成虫DNA。在敏感虫体，采用α-和β-微管蛋白DNA探针时，最多有6个不同组分，但在耐药株，仅有一种或两种组分与β-微管蛋白探针相符，说明苯并咪唑耐药虫株可能比敏感虫株多了一个变化了的β-微管蛋白基因，耐药虫株β-微管蛋白可能更低表达苯并咪唑敏感株β-微管蛋白同种型，或表达的β-微管蛋白缺乏与药物的高度结合性。一种等位基因特异性PCR报告可检测氨基酸取代(Phe取代Tyr)在捻转血矛线虫的β-微管蛋白同种型Ⅰ基因200，对于苯并咪唑耐药十分重要，后来也有等位基因特异性PCR的报道[11]。

(2)大环内酯类药物 阿维菌素类和美贝霉素类作用机制可能是药物与谷氨酸门控氯离子通道的α-亚基结合，打开或者门控通道，导致靶神经肌细胞的超极化，谷氨酸与β-亚基结合门控通道[41]。捻转血矛线虫采用单链多肽现象分析α-亚基的克隆片段，显示阿维菌素耐药可能与这个亚基基因的两个等位基因的频率变化有关。对P-gp的研究显示P-gp具有细胞膜药物转运功能，提示可能会参与到大环内酯类药物耐药[42]。总之，大环内酯类药物耐药的机制概括为：①β-微管蛋白同种型Ⅱ突变；改变代谢或吸收机制；②谷氨酸和或γ-氨基丁酸-R基因突变；③P-gp的超量表达[43]。

(3)左咪唑 左咪唑的耐药可能与nAChR的减少或结合位点改变有关。左咪唑耐药捻转血矛线虫的理化特性研究显示左咪唑受体的配体结合特性在耐药和敏感虫株间的变化不明显[44]。同样的，虽然捻转血矛线虫的序列分析和分离的nAChR基因RFLP显示氨基酸序列的多态性，但未检测到与耐药的相关性，不同种属左咪唑耐药虫株的耐药分析过程中均未发现特异性hcal等位基因的改变。

3 小 结

驱虫药耐药导致药物效能下降而不能有效控制疾病，集约化养殖模式更趋向于用化疗药物控制寄生虫，但任何一种驱虫药的长期应用都会导致耐药的产生。世界范围内寄生虫对一种或几种广谱驱虫药的耐药已引起了相应研究部门的关注，为保证可用的化合物能够持续有效地用于养殖业，药物的有效性就需要有效监控。因此，正确给药至关重要，即可保证畜牧业发展，也可限制耐药进一步发生。灵敏、快速的耐药检测方法与其应用方式结合起来，为减少或避免耐药的产生奠定基础。

参考文献：

[1] Coles G, Jackson F, Pomroy W, et al. The detection of anthelmintic resistance in nematodes of veterinary importance[J]. Veterinary parasitology,2006, 136(3): 167-185.

[2] Boersema J H. Possibilities and limitations in the detection of anthelmintic resistance. Facts and reflections IV Resistance of parasites to anthelmintics[C]// Lelystad, The Netherlands : A workshop in the CEC animal pathology programme held at the Central Veterinary Institute, 1982: 207-215.

[3]Presidente P J A. Methods for detection of resistance to anthelmintics[M]. New South Wales, Australia : CSIRO, Division of Animal Healthn Wool Corporation, 1985: 13-27.

[4] Kaplan R M , Vidyashankar A N. An inconvenient truth: Global worming and anthelmintic resistance[J]. Veterinary parasitology,2012, 186(1): 70-78.

[5] Levecke B, Rinaldi L, Charlier J, et al. The bias, accuracy and precision of faecal egg count reduction test results in cattle using McMaster, Cornell-Wisconsin and FLOTAC egg counting methods[J]. Veterinary parasitology, 2012, 188(1): 194-199.

[6] Calvete C ,Uriarte J. Improving the detection of anthelmintic resistance: evaluation of faecal egg count reduction test procedures suitable for farm routines[J]. Vet Parasitol,2013, 196(3-4): 438-452.

[7] Jackson F. Anthelmintic resistance-the state of play[J]. British Veterinary Journal,1993, 149(2): 123-138.

[8] Levecke B, Speybroeck N, Dobson R J, et al. Novel insights in the fecal egg count reduction test for monitoring drug efficacy against soil-transmitted helminths in large-scale treatment programs[J]. PLoS neglected tropical diseases, 2011, 5(12): e1427.

[9] Mcmahon C, Bartley D J, Edgar H W, et al. Anthelmintic resistance in Northern Ireland (I): prevalence of resistance in ovine gastrointestinal nematodes, as determined through faecal egg count reduction testing[J]. Vet Parasitol,2013, 195(1-2): 122-130.

[10] Matthews J B, Mcarthur C, Robinson A, et al. The in vitro diagnosis of anthelmintic resistance in cyathostomins[J]. Vet Parasitol,2012, 185(1): 25-31.

[11] Robles-Perez D, Martinez-Perez J M, Rojo-Vazquez F A, et al. The diagnosis of fasciolosis in feces of sheep by means of a PCR and its application in the detection of anthelmintic resistance in sheep flocks naturally infected[J]. Vet Parasitol. 2013, 197(1-2): 277-282.

[12] Flanagan A, Edgar H, Gordon A, et al. Comparison of two assays, a faecal egg count reduction test (FECRT) and a coproantigen reduction test (CRT), for the diagnosis of resistance to triclabendazole in Fasciola hepatica in sheep[J]. Veterinary parasitology,2011, 176(2): 170-176.

[13] Wood I, Amaral N, Bairden K, et al. World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology (WAAVP) of guidelines for evaluating the efficacy of anthelmintics in ruminants (bovine, ovine, caprine) [J]. Veterinary parasitology,1995, 58(3): 181-213.

[14] Kerboeuf D, Hubert J, Mallet S. Haemonchus contortus: infectivity and resistance to benzimidazoles[J]. Veterinary Record,1989, 124(15): 399-400.

[15] Martin P, Anderson N, Jarrett R. Detecting benzimidazole resistance with faecal egg count reduction tests and in vitro assays[J]. Australian Veterinary Journal,1989, 66(8): 236-240.

[16] Taylor M, Hunt K, Goodyear K. Anthelmintic resistance detection methods[J]. Veterinary parasitology, 2002, 103(3): 183-194.

[17] Calvete C, Calavia R, Ferrer L, et al. Management and environmental factors related to benzimidazole resistance in sheep nematodes in Northeast Spain[J]. Veterinary parasitology,2012, 184(2): 193-203.

[18] Von Samson-Himmelstjerna G, Coles G C, Jackson F, et al. Standardization of the egg hatch test for the detection of benzimidazole resistance in parasitic nematodes[J]. Parasitol Res,2009, 105(3): 825-834.

[19] Martin P , Le Jambre L. Larval paralysis as an in vitro assay of levamisole and morantel tartrate resistance in Ostertagia[J]. Veterinary Science Communications, 1979, 3(1): 159-164.

[20] Sutherland I , Lee D. A larval paralysis assay for the detection of thiabendazole resistance in trichostrongyles[J]. Parasitology,1990, 100(01): 131-135.

[21] Bennett J , Pax R. Micromotility meter: an instrument designed to evaluate the action of drugs on motility of larval and adult nematodes[J]. Parasitology,1986, 93(02): 341-346.

[22] Bennett J , Pax R. Micromotility meter: instrumentation to analyse helminth motility[J]. Parasitology Today,1987, 3(5): 159-160.

[23] Coles G, Folz S, Tritschler Ii J. Motility response of levamisole/benzimidazole-resistant Haemonchus controtus larvae[J]. Veterinary parasitology,1989, 31(3): 253-257.

[24] Gill J H, Redwin J M, Van Wyk J A, et al. Detection of resistance to ivermectin in haemonchus contortus[J]. International journal for parasitology,1991, 21(7): 771-776.

[25] Petersen M B, Craven J,Bjørn H, et al. Use of a migration assay for the separation of adult pyrantel-susceptible and-resistant Oesophagostomum dentatum[J]. Veterinary parasitology, 2000, 91(1): 141-145.

[26] Grimshaw W, Hunt K, Hong C, et al. Detection of anthelmintic resistant nematodes in sheep in southern England by a faecal egg count reduction test[J]. Veterinary Record,1994, 135(16): 372-374.

[27] Amarante A, Pomroy W, Charleston W, et al. Evaluation of a larval development assay for the detection of anthelmintic resistance in Ostertagia circumcincta[J]. International journal for parasitology, 1997, 27(3): 305-311.

[28] Hubert J , Kerboeuf D. A microlarval development assay for the detection of anthelmintic resistance in sheep nematodes[J]. Veterinary Record,1992, 130(20): 442-446.

[29] Demeler J, Kuttler U, Von Samson-Himmelstjerna G. Adaptation and evaluation of three different in vitro tests for the detection of resistance to anthelmintics in gastro intestinal nematodes of cattle[J]. Vet Parasitol, 2010, 170(1-2): 61-70.

[30] Kotze A C, Le Jambre L F, O'grady J. A modified larval migration assay for detection of resistance to macrocyclic lactones in Haemonchus contortus, and drug screening with Trichostrongylidae parasites[J]. Vet Parasitol, 2006, 137(3-4): 294-305.

[31] Kotze A, Clifford S, O'grady J, et al. An in vitro larval motility assay to determine anthelmintic sensitivity for human hookworm and Strongyloides species[J]. The American journal of tropical medicine and hygiene,2004, 71(5): 608-616.

[32] Kopp S R, Coleman G T, Mccarthy J S, et al. Application of in vitro anthelmintic sensitivity assays to canine parasitology: Detecting resistance to pyrantel in Ancylostoma caninum[J]. Veterinary parasitology,2008, 152(3): 284-293.

[33] 徐倩倩, 李继昌, 郭时金, 等. 米尔贝肟对犬钩虫的体外作用[J]. 中国兽医科学，2012, 42(8): 861-864.

[34] Hawdon J ， Schad G. Serum-stimulated feeding in vitro by third-stage infective larvae of the canine hookworm Ancylostoma caninum[J]. The Journal of parasitology，1990,76(3):394-398.

[35] Martínez-Valladares M, Famularo M, Fernández-Pato N, et al. Characterization of a multidrug resistant Teladorsagia circumcincta isolate from Spain[J]. Parasitol Res，2012, 110(5): 2 083-2 087.

[36] Alvarez-Sanchez M, Pérez García J, Bartley D, et al. The larval feeding inhibition assay for the diagnosis of nematode anthelmintic resistance[J]. Exp Parasitol，2005, 110(1): 56-61.

[37] Stringfellow F. Effects of bovine heme on development of Haemonchus contortus in vitro[J]. The Journal of parasitology，1984, 70(6): 989.

[38] Lacey E, Redwin J, Gill J, et al. A larval development assay for the simultaneous detection of broad spectrum anthelmintic resistance[C]// Paris:In Round Table Conference 7th Int Congress of Parasitology, 1990.

[39] Wolstenholme A J, Fairweather I, Prichard R, et al. Drug resistance in veterinary helminths[J]. Trends in parasitology,2004, 20(10): 469-476.

[40] Roos M H, Boersema J H, Borgsteede F H, et al. Molecular analysis of selection for benzimidazole resistance in the sheep parasite Haemonchus contortus[J]. Molecular and biochemical parasitology,1990, 43(1): 77-88.

[41] Lespine A, Ménez C, Bourguinat C, et al. P-glycoproteins and other multidrug resistance transporters in the pharmacology of anthelmintics: Prospects for reversing transport-dependent anthelmintic resistance[J]. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance, 2012, 2: 58-75.

[42] Xu M, Molento M, Blackhall W, et al. Ivermectin resistance in nematodes may be caused by alteration of P-glycoprotein homolog[J]. Molecular and biochemical parasitology,1998, 91(2): 327-335.

[43] Viljoen G J , Luckins A G. The role of nuclear technologies in the diagnosis and control of livestock diseases--a review[J]. Trop Anim Health Prod,2012, 44(7): 1 341-1 366.

[44] Hoekstra R, Visser A, Wiley L J, et al. Characterization of an acetylcholine receptor gene of haemonchus contortus in relation to levamisole resistance[J]. Molecular and biochemical parasitology,1997, 84(2): 179-187.