牛精原干细胞研究进展

王春伟，扶晓波，吕 妍，赵 军，郭秋萍，张卫艺，胡建宏

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

精子发生是雄性动物终身产生大量精子的一个过程，其特点是由二倍体生殖细胞(精原干细胞)的单向分化，通过减数分裂形成精母细胞，最后产生单倍体配子精子[1]。精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是哺乳动物出生后唯一能进行自我更新并将遗传信息传递给后代的具有像胚胎干细胞一样增殖和分化潜能的干细胞[2]。精原干细胞的建立，不仅提供了一种新的工具来分析精子发生或干细胞的自我更新，同时也开辟了干细胞实际应用的新领域。本文通过分析牛精原干细胞分离纯化、培养鉴定、冷冻保存和诱导分化的研究现状，指出目前存在的主要问题，并展望其应用前景，以期为精原干细胞的研究提供借鉴。

1 牛精原干细胞的发生

精原干细胞位于睾丸曲细精管的上皮基底膜上，由四周的支持细胞紧密连接，主要参与精子发生，通过自我更新维持生殖干细胞稳定或自我分化成一定数量的精母细胞，并最终发育成精子，保证雄性动物正常的生殖能力。精原干细胞起源于原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)，而PGCs起源于胚胎外胚层细胞。PGCs从尿囊基部沿后肠迁移到双侧生殖腺嵴，在雄性生殖腺嵴PGCs被支持细胞的前体细胞所包围，然后与支持细胞一起形成生殖索。PGCs演化为生殖母细胞(性原细胞)，即精原干细胞的前体细胞。雄性动物睾丸曲细精管中存在As(single)、Apr(paired)、Aal(aligned)、A1、A2、A3、A4等多个时期的细胞[2]。精原干细胞的发育顺序为As-Apr-Aal-A1-A2-A3-A4-I-B-Spc。As型(type-A single spermatogonia)细胞为精子发生过程中的干细胞，是成体内唯一能将遗传信息传递给后代的干细胞[3]。在体内，基于超微结构特征可将牛的精原细胞前体细胞分为基地干细胞(BSCs)、集合精原细胞前体细胞(ASPCs)和定向精原细胞前体细胞(CSPCs)三类。其中BSCs见于25和30周龄的犊牛睾丸内，而在成年牛睾丸内数量很少。BSCs呈圆形，有一格位于胞质中央的核。在25周龄的犊牛睾丸内，多数生精细胞属ASPCs，一般多个紧密相邻存在。CSPCs一般具有核周体和胞质突起，核的轮廓呈球形或卵圆形。

2 牛精原干细胞的分离纯化

精原干细胞的生物学研究需要大量高活性、高纯度的细胞。但是，睾丸中精原干细胞的数量非常少，需要成熟的分离和纯化技术。目前分离精原干细胞的常用方法有机械分离法、组合酶分离法等。牛精原干细胞常用的分离方法是在两步酶消化法和Percoll分离法的基础上进行。Yang等[4]研究发现，机械法与酶消化法相结合比单纯使用机械法的活细胞获得率提高约9倍。在分离方法中，采用不同的酶进行消化，例如分散酶、胰蛋白酶及IV型胶原酶等，也可单用或多种酶联合使用，通过两步法消化获得精原干细胞[5-6]。目前常用的纯化方法主要有差速贴壁法[5]、磁激活分选[7]等。Lzadyar等[8]结合差异贴壁和Percoll密度梯度离心法得到了纯度为73 %的小牛A型精原细胞。

3 牛精原干细胞的培养鉴定

3.1 精原干细胞的培养

体外大量增殖培养精原干细胞是研究细胞功能的基本要求。Aponte等[9]采用小鼠精原干细胞培养体系进行牛精原干细胞分离培养，使精原干细胞增殖10000倍，但仅能培养1个月。饲养细胞层可以支持精原干细胞的体外培养，常用的饲养层细胞有MEF(mouse embryonic fibroblasts)细胞[5]、STO(SIM mouse embryoderived thioguanine and ouabain resistant)细胞[7]等。Kubota等[10]选用体外精原干细胞无血清培养体系，发现饲养层对于精原干细胞必不可少。Lzadyar等[8]研究发现，适量的血清可以明显改善精原干细胞的存活和增殖情况，但高浓度的血清会导致精原干细胞的分化[7,11]。在一些非支持细胞作为饲养层的培养体系中，常需要添加乳酸盐和丙酮酸盐[12]。根据所选基础培养基的不同，有时候还需要添加 Hepes、谷氨酰胺、非必须氨基酸等[13]；生长因子如GDNF和LIF等，也可促进精原干细胞体外扩增[14-15]。

3.2 精原干细胞的鉴定

精原干细胞的鉴定主要包括形态学鉴定、细胞表面特异性标记鉴定和干细胞功能鉴定等。

对于多数哺乳动物而言，精原干细胞的形态学特征是较睾丸体细胞体积大，呈圆形或椭圆形，细胞间由间桥连接，胞核较大，核仁常位于中央。颗粒较少，核不明显，常见2个或多个[16]。常用的染色鉴定的方法有AP染色法、免疫荧光染色法[17-18]、碱性磷酸酶染色法[19]。在基因鉴定方面，精原干细胞具有与其他干细胞相似的一些标志物，例如Oct4、Thy-1、β1-integrin和α6-integrin、CD9、CD2为阳性；CD51、MHC-I、c-kit、Sca、CD34为阴性。未分化的A型精原细胞标志有Ngn3+基因[20]、C-Ret[20]、CDH1[21]、PGP9.5[22]等。GFRA1、OCT-4、c-Ret是目前体外鉴定精原干细胞常用的表面标志物。Prdm1和Dppa3是早期生殖细胞标志基因[23]。Thy-1、GFRa-1、c-kit为精原干细胞在生长发育过程中不同阶段表达的部分标志物[24]。CD133、VASA、DAZL和TSPYL2等在精原干细胞中特异性表达[25]。Foxo1是未分化精原干细胞的表面标志，对于维持精原干细胞的稳定和启动精子发生过程有重要作用，Foxo1、Foxo3和Foxo4，可维持精原干细胞功能[26]。Stra8是哺乳动物生殖细胞有丝分裂变为减数分裂前的特异表达基因[27]。

4 牛精原干细胞的冷冻保存

精原干细胞体外培养与冷冻保存技术相结合，为保护珍稀动物和优良家畜遗传资源提供又一条新的途径[28]。常用的抗冻剂可以分为渗透性抗冻剂和非渗透性抗冻剂。渗透性冷冻保护剂主要有甘油(Glycerol)、二甲基亚砜(Dimethyl sulphoxide, DMSO)、丙二醇(Propylene glycol, PROH)、乙二醇(Ethyleneglycol, EG)、木糖醇、乙酰胺、阿东糖醇等。非渗透性保护剂主要有蔗糖(Sucrose)、海藻糖(Trehalase)、聚蔗糖(Ficoll)、葡聚糖(Dextran)、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinyl pyrrolidone, PVP)、聚已二醇(Polyethylene glycol, PEG)以及白蛋白(Albumin) 等。郑鹏等[29]研究发现，以10%的二甲基亚砜为冷冻剂冷冻保存精原干细胞效果最好；冷冻保存支持细胞以10%乙二醇和0.1 mmol/L海藻糖组合冷冻效果最好；Izadyar等[30]表明，使用含有MEM+10%FCS+10%DMSO+0.07M蔗糖的冻存液，采用慢速降温冷冻方式，冷冻复苏后可获得70%以上的细胞活率；马良宏等[31]采用常规方法冷冻保存的精原干细胞移植后仍保持其增殖分化和形成成熟精子的能力；丁晓麟等[32]采用非程控降温方法冻存精原干细胞后，复温后细胞能够快速增殖。

5 牛精原干细胞的诱导分化

Sato[33]和Takashi等[34]研究发现，精原干细胞有归巢行为和克隆形成的能力，这些均与微环境分泌的趋化因子有关，如胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-line derived neurotrophic factor, GDNF)和基质细胞衍生因子-1(stromal-derived factor 1, SDF-1)，从而探究精原干细胞在曲细精管中的行为。Kanatsu-Shinohara等[35]成功将新生小鼠SSCs诱导为胚胎干细胞样(ES-like)细胞。Guan等[36]收集成年小鼠的SSCs，在特定的培养条件下也具有了ES的特性，并将这些细胞命名为多能性成体生殖干细胞(maGSCs)。Simon等[37]首次报道将新生SSCs置于诱导性微环境转分化为三个胚层的组织。Kossack等[38]发现SSCs表达与胚胎干细胞标记物相似的标志，表明SSCs具有类似ES的多潜能性。目前，关于牛精原干细胞诱导分化方面的研究较少，但已经初步建立牛精原干细胞体外培养体系及体外分析鉴定牛精原干细胞分化能力的基本方法。

6 牛精原干细胞研究存在的主要问题

动物睾丸中精原干细胞的数量和比例很低，随着年龄的增加，精原干细胞比例明显降低，所以获得并富集精原干细胞的难度增加。牛出生后5～7月龄更容易获得大量精原干细胞[39]。精原干细胞的分裂增殖需要适宜的环境和良好的条件，温度、细胞因子都对精原干细胞的分裂增殖有影响[3]。目前精原干细胞体外培养存在争议[40]，培养基的成分复杂，含有各种生长因子，对SSCs作用不清楚，不利于精原干细功能的研究，需要找到更合适的培养基。对小鼠等模式动物精原干细胞的培养已经成熟，但对牛等家畜大动物的精原干细胞的特定的培养技术体系仍处于探索阶段。因此，需要深入研究牛的精原干细胞的体外培养体系，探究精原干细胞的自我更新和分化机制，实现牛精原干细胞的长期培养。

目前利用雄性精原干细胞介导的技术已经制备出转基因动物[41]，为濒危动物的保种[42]提供高效而简便的途径。近年来，精原干细胞开始应用于研究治疗原发性无精子症，对于解决雄性不育等问题具有广阔的应用前景[43]。精原干细胞增殖培养、诱导分化与动物育种技术相结合，将会大规模的生产优良家畜，为人类带来优质的动物产品。精原干细胞的冷冻保存与移植技术的联合有重要的实践意义。在医学、干细胞生物学以及畜牧业生产方面，精原干细胞体外增殖培养以及诱导分化的研究具有重要的理论意义及广阔的应用前景。

参考文献：

[1] Oatley J M and Brinster R L. Regulation of spermatogonial stem cell self-renewal in mammals[J]. Annu Rev Cell Dev Biol, 2008, 24: 263-286.

[2] Ehmcke J, Wistuba J, Schatt S.Spermatogonial stem cells: questions, models and perspectives [J]. Hum Reprod Update, 2006, 12(3):275-282.

[3] 张学明，李德雪，于家傲，等.精原干细胞的生物学特性[J].细胞生物学杂志，2006，28(1): 37-41.

[4] Li S L, Wang X H, Yang Z H, et al. Comparion of mechanical procedure and enzymatic digestion methods in isolating spermatogenic cells from rat tests[J].Chinese Journal of Tissne Engineering Rdsearch,2007, 11(50):10 105-10 108.

[5] Shen F, Zhang C, Zheng H, et al. Long-term culture and transplantion of spermatogonial stem cells from BALB/cmice[J]. Cells Tissues Organs, 2010, 191(5):372-381.

[6] Wu Z, Luby-Phelps K, Bugde A, et al. Capacity for stochastic self-renewal and differentiation in mammalian spermatogonial stem cells[J]. J Cell Biol, 2009, 187(4):513-524.

[7] Kubota H, Avarbock M R,Brinster R L. Culture conditions and single growth factors affect fate determination of mouse spermatogonial stem cells [J]. Biol Reprod, 2004, 71(3): 722-731.

[8] Izadyar F,Spierenberg G T,Creemers L B,et al. Isolation and purification of type A spermatogonia from the bovine testis[J].Reproduction,2002 ,124 (1) :85-94.

[9] Aponte P M, Soda T, Teerds K J, et al. Propagation of bovine spermatogonial stem cells in vitro [J]. Reproduction, 2008, 136(5):543-557.

[10] Kubota H, Avarbock M R, Brinster R L. Growth factors essential for self renewal and expansion of mouse spermatogonial stem cells [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA,2004, 101 (47):16 489-16 494.

[11] Kanatsu-shinohara M, Miki H, Inoue K, et al. Long-term culture of mouse male germline stem cells under serum-or feeder-free conditions[J].Bio Reprod, 2005, 72(4):985-991.

[12] 阿拉达尔.山羊精原干细胞体外培养体系的建立与移植研究[D].陕西杨凌:西北农林科技大学，2007.

[13] 张学明，李德雪，岳占碰.精原干细胞的体外增殖与分化[J].中国农学通报，2005，21(5)：16-23.

[14] 李恩中，李德雪，张世庆，等.精原干细胞移植及体外培养研究进展[J].军事医学科学院院刊，2006，30(3): 280-283.

[15] Koruji M, Movahedin M, Mowla S J, et al. Efficiency of adult mouse spermatogonial stem cell colony formation under several culture conditions [J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim.2009, 45(5-6):281-289.

[16] Yoshida S. Stem Cell Niche System in Mouse Spermatogenesis[M].Male Germline Stem Cells:Developmental and Regenerative Potential, 2011:159-175.

[17] Kossack N, Meneses J, Shefi S, et al. Isolation and characterization of pluripotent human spermatogonial stem cell-derived cells [J]. Stem Cells, 2009, 27(1): 138-149.

[18] 潘少辉，胡玥，张姗姗，等.成年昆明小鼠雄性生殖干细胞的分离培养及其多能性研究[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2010，38(6): 23-30.

[19] 李莲军，陆峻波，施江滨，等.碱性磷酸酶细胞化学法检测体外培养精原细胞[J].云南农业大学学报，2004，19(3): 318-321.

[20] Yoshida S, Takakura A, Ohbo K,et al. Neurogenin3 delineates the earliest stages of spermatogenesis in the mouse testis[J]. Dev Biol, 2004, 269(2): 447-458.

[21] Tokuda M, Kadokawa Y, Kurahashi H, et al. CDH1 is a specific marker for undifferentiated spermatogonia in mouse testes[J]. Biol Reprod, 2007, 76(1): 130-141.

[22] Luo J, Megee S, Rathi R,et al. Protein gene product 9.5 is a spermatogonia-specific marker in the pig testis: Application to enrichment and culture of porcine spermatogonia[J]. Mol Reprod Dev, 2006, 73(12): 1 531-1 540.

[23] Kee K, Angeles V T, Flores M, et al. Human DAZL, DAZ and BOULE genes modulate primordial germ-cell and haploid gamete formation[J]. Nature, 2009, 462(7270):222-225.

[24] Yeh J R, Nagano M C. Spermatogonial stem cell biomarkers: improved outcomes of spermatogonial transplantation in male fertility restoration[J]. Expert Rev Mol Diagn,2009, 9(2):109-114.

[25] Kanatsu-Shinohara M, Takashima S, Ishii K, et al. Dynamic changes in EPCAM expression during spermatogonial stem cell differentiation in the mouse testis[J]. Plos One, 2011, 6(8):e23663.

[26] Goertz M J, Wu Z, Gallardo T D, et al. Foxo1 is required in mouse spermatogonial stem cells for their maintenance and the initiation of spermatogenesis [J]. J Clin Invest, 2011, 121(9):3 456-3 466.

[27] Anderson E L, Baltus A E, Roepers-Gajadien H L,et al. Stra8 and its inducer, retinoic acid, regulate meiotic initiation in both spermatogenesis and oogenesis in mice[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(39):14 976-14 980.

[28] 唐 红，石国庆，管 峰，等.精原干细胞体外培养研究进展[J].动物医学进展，2008，29(6): 87-89.

[29] 郑 鹏，李冬旭，田亚光，等.新生牛睾丸细胞的分离纯化与冷冻保存[J].2010，41(2)：96-100.

[30] Izadyar F, Den Ouden K, Creemers L B, et al. Proliferation and differentiation of bovine type A spermatogonia during long-term culture [J]. Bio Reprod, 2003, 68(1), 272-281.

[31] 马良宏，丁 强，冯立新，等.精原干细胞冷冻保存后再移植的生精功能[J].中组织工程研究与临床康复,2010，31(14)：5 767-5 772.

[32] 丁晓麟，张寒莹，王子玉，等.小鼠精原干细胞冷冻保存[J].解剖学报，2009，40(4)：685-689.

[33] Sato T, Katagiri K, Yokonishi T, et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines[J]. Nature Communication, 2011, 2:472.

[34] Takashi N, Atsuo O, Talashi S. Reconstitution of mouse spermatogonial stem cell niches in culture[J]. Cell Stem Cell, 2012, 11(4):567-578.

[35] Kanatsu-Shinohara M, Inoue K, Lee J，et al. Generation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis [J]. Cell, 2004, 119:1 001-1 012.

[36] Guan K, Nayernia K, Maier L S, et al. Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mouse testis [J]. Nature, 2006, 440:1 199-1 203.

[37] Simon L, Ekman G C, Kostereva N, et al. Direct Transdifferentiation of Stem/Progenitor Spermatogonia Into Reproductive and Nonreproductive Tissues of All Germ Layers [J]. Stem Cells, 2009, 27(7): 1 666-1 675.

[38] Kossack N, Meneses J, Shefi S, et al. Isolation and Characterization of Pluripotent Human Spermatogonial Stem Cell-Derived Cells[J]. Stem Cells, 2009,27(1): 138-149.

[39] Herrid M, Vignarajan S, Davey R, et al. Successful transplantation of bovine testicular cells to heterologous recipients [J].Reproduction, 2006,132(4):617-624.

[40] Nagano M C, Techniques for culturing spermatogonial stem cells continue to improve[J]. Biol Reprod, 2011, 84(1):5-6.

[41] Zhao Q, Wang J L, Zhang Y, et al. Generation of histocompatible androgenetic embryonic stem cells using spermatogenic [J]. Stem Cells, 2010, 2(28): 229-239.

[42] Olive V, ois Cuzin F. The spermatogonial stem cell：from basic knowledge to transgenic technology [J]. Int J Biochem Cell Biol, 2005, 37: 246-250.

[43] Kubota H, Brinster R L. Technology Insight: in vitro culture of spermatogonial stem cells and their potential therapeutic uses [J]. Nature Revs Endocrinol, 2006, 2: 99-108.