抗氧化剂对家畜精液冷冻保存的应用研究进展

贾永宏，马国际，王春伟，洪洁赟，胡建宏*

(1．陕西省家畜改良站，陕西 泾阳 713702；2．西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

从20世纪科学家开始研究家畜精液冷冻技术开始，经过多年不断的深入探索，目前牛的冷冻精液已经商业化生产，广泛用于人工授精技术。目前牛的冷冻精液在家畜中最为成功，但冷冻-解冻过程发生的脂质过氧化反应降低了精子质量，并导致40%～50%的精子失去活力。在稀释液中添加抗氧化剂可以清除精液冷冻-解冻过程中产生的过多活性氧(reactive oxygen species, ROS)，提高精子抗氧化损伤的能力，进一步提升家畜冷冻精液的质量。本文就目前一些主要的维生素、抗氧化酶等抗氧化剂在家畜精液冷冻保存中的应用进行综述，以期为进一步提高家畜冷冻精液的品质提供一定的基础，切实提高家畜冷冻精液的质量。

1 精液冷冻-解冻过程氧化损伤机理

在冷冻-解冻过程中，很多物理和化学反应发生在精子膜上，降低了精子活力和受精能力。Aitken等[1]研究认为，ROS通过引发精子膜上的多聚不饱和脂肪酸发生过氧化反应，由于产生大量脂类过氧化物，导致精子膜不可逆地被破坏或消失，直接抑制精子的运动性能。精子存活率的高低反映精子生存能力和精子质量的优劣，而精子运动能力是正常成熟精子的重要功能，是精子受精能力高低的重要指标之一。Chatterjee等[2]研究认为，在冷冻精液的制作过程中，由于外界各种因素的相互作用，增加了死亡精子和受损精子的数量，导致产生ROS。精子的冷应激和冷冻损伤都是由ROS和氧应激的产生所引起，过氧化损伤是冷冻-解冻后精子质量下降的重要原因。在正常生理条件下，精子的ROS处于一种动态平衡状态，在精液的冷冻-解冻过程中因精子与外界环境相接触，致使这种平衡状态被打破，精子ROS增加，引起精子膜的流动性改变，线粒体和DNA损伤，降低了精液品质[2]。

2 抗氧化剂对冷冻精液品质的影响

2.1 维生素类抗氧化剂

2.1.1 维生素E 维生素E又名α-生育酚，是动物身体重要的抗氧化剂，对组织线粒体、网状组织或浆膜的磷脂有着特殊的亲和性，并且存在于细胞膜的特定部位。Ball等[3]研究认为，在马的精液稀释液中添加维生素E后明显提高了精子活力和顶体完整率，说明维生素E对精子具有冷冻损伤具有保护作用。罗海玲等[4]研究认为，绵羊冷冻精液的稀释液中补充维生素E后，因为自由基的形成受到抑制，有效预防或阻止脂质过氧化的诱发，保护精子细胞膜免受氧化损伤，同时保护了精子膜酶的活性。Pena等[5]研究证明，在猪冷冻精液稀释液中加入维生素E可以改善冻后精子质量，但其添加量不应超过200 μg/ mL，否则对精子产生一定的毒害作用。在牛的冷冻精液稀释液中添加维生素E后，不仅能够有效提高精子的运动性能和顶体完整率，而且能够显著提高过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶( GSH) 、谷胱甘肽还原酶( GR) 的活性[6]。Hu等[7]研究表明，稀释液中添加维生素E能够增强牛精子抗氧化酶的活性，从而提高精子冷冻-解冻后的质量，其适宜剂量为1.5 mg/ml。Sicherle等[8]研究认为，稀释剂中补充维生素E的相似物(Trolox)也能够显著降低由于氧化应激导致的脂质过氧化，但精子功能损伤的具体机制不甚清楚，有待于进一步深入探索。

2.1.2 维生素C 维生素C又称为抗坏血酸维生素C，是一种抗氧化物质，能够有效防止精液冷冻过程中精子磷脂发生过氧化反应，提高冻后精子质量。Foote等[9]研究证实，稀释液中添加维生素C可以明显减少丙二醛(MDA)的含量，提高冷冻-解冻后牛精子的活力。在低温保存条件下，由于精子暴露在有氧环境中，发生氧化反应而产生自由基，致使细胞高度突变和异化，减弱精子的受精能力。Mustafa等[10]研究发现，羊精液稀释液中添加的维生素C含量不高于2 mg/ml时，对精子运动性能和形态无明显影响，但如果添加量达到5～10 mg/mL时，则可明显抑制精子的代谢，延长精子的存活时间，这可能与维生素C偏酸有关。Cheede等[11]研究表明，稀释液中补充维生素C明显改善了精液质量，提高了人工授精后水牛的受胎率。赵宪林等[12]用含有维生素C的冷冻稀释液冷冻奶牛X精子，发现在短时间解冻后精子活率变化不显著，但随着解冻时间的延长，维生素C具有减缓精子死亡的作用，且证明其添加量为4～6 mg/mL时可有效提高荷斯坦公牛X精子解冻后的活率、质膜完整率及顶体完整率。

2.1.3 维生素B12维生素B12是一种含钴的三价化合物，又名钴维生素，是一种生理活性物质，能够改善精子的外在环境，提高精子的活力。维生素B12的辅酶能使氧化型(-S-S-)辅酶A还原成还原型(-SH-)辅酶A，满足酶反应的需要，同时也可使氧化型谷胱甘肽和高胱氨酸还原成还原型，而还原型谷胱甘肽对精子代谢发挥重要活性。李玉凡等[13]发现维生素B12注射液解冻奶牛颗粒冻精可提高精子顶体完整率，降低精子畸形率。孙淑琴等[14]研究表明，在稀释液中采用一定浓度的维生素B12注射液作为保护精子的添加剂是可行的，但当其浓度达1%时，精子活力降低，其作用机理有待于进一步研究。

2.2 酶类抗氧化剂

动物精子抗氧化系统中的主要成分有超氧化物歧化酶( SOD)、谷胱甘肽还原酶( GSH)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、辅酶Q10以及精子本身所具有的还原型辅酶Ⅱ(NADPH)依赖性谷胱甘肽过氧化酶与还原酶(GR)系统等[15-16]，可以清除O2-、H2O2等，防止过氧化反应的产生。精子的抗氧化体系中SOD、CAT、GSH和GSH-Px对维持家畜精子的活力和运动能力发挥重要作用。但是，精液冷冻-解冻后其抗氧化酶的活性下降，不能满足消除过多ROS的需要，因而可在精液冷冻时适当添加一定量的抗氧化酶类，减少精子的氧化损伤[17-18]。Kasimanickam等[19]研究证明，GSH-Px、SOD对保护羊精液免受ROS的毒害具有非常重要的作用。Sariozkan等[20]比较了GSH-Px、GSH和牛血清白蛋白(BSA)对牛精子活力、顶体异常率、质膜完整性、抗氧化酶活性以及精子受精能力的影响，表明稀释液中添加BSA时母牛妊娠率最高。张文举等[21]在牛精液稀释中添加GSH后发现精子活力和母牛受胎率明显提高。易康乐等[22]研究发现，冷冻保存液中加入300 IU/mL的SOD 或1.0 mM GSH，可以显著提高水牛精子冻后活率、存活时间以及囊胚孵化率。Tuncer等[23]研究了半胱氨酸和谷胱甘肽对牛精子氧化应激的影响，发现对精子形态影响不显著，但精子DNA的损害程度降低。

2.3 其他抗氧化剂

海藻糖是一种非还原性糖，性质稳定，可以减缓细胞内外渗透压的变化，从而保护细胞分子结构不被破坏。Chen[24]等研究证明，海藻糖能提高冷冻保存的牛精子活力，延长精子存活时间。昝林森等[25]研究表明，单独添加海藻糖、牛血清白蛋白(BSA)及其相互配伍对牛精液的冷冻效果显著优于对照组。稀释液中单独添加不同水平的海藻糖或BSA 对冻后牛精子活率和质膜完整率均有明显影响，但对顶体完整率影响不大。Hu等[26]的研究表明，稀释液中添加海藻糖可以降低由冷冻-解冻引起的氧化应激，提高冷冻-解冻后牛精液品质。

褪黑激素具有高亲脂性和部分亲水性，能够抑制过氧化氢引起的过氧化脂质含量的升高，有效清除在化学反应中产生的羟自由基，对细胞膜、细胞质和细胞核中发挥强大的抗氧化作用[27]。李博玲等[28]分别在稀释液中单独添加褪黑素、谷胱甘肽或两者联合添加，发现均能减少猪精液冷冻过程中ROS的生成，显著提高冻后精子质量，并且联合添加效果显著优于单独添加效果。张渭斌等[29]试验表明，稀释液中补充0.2、0.4 mg/mL的咖啡因时，猪精子冷冻后活力、质膜完整率、顶体完整率显著高于其他组。Jiang等[30]的研究认为，稀释液中添加低密度脂蛋白能够有效提高猪精液品质。张婷等[31]、潘巧莲等[32]分别将海带多糖和红景天多糖添加到猪精液的冷冻稀释液中，结果表明这两种多糖均可以有效提高精子在冷冻过程中抵抗氧化损伤的能力，改善精液质量。

3 抗氧化剂研究存在问题与发展

精液冷冻保存作为一种先进的繁殖技术，在提高优良种公畜的配种效率、加快品种改良进程、疾病防治及提高经济效益等方面发挥着重要作用。多年来，科学家一直尝试在家畜冷冻精液稀释液或者解冻液中添加各种抗氧化剂，以便清除冷冻-解冻过程中产生的过多活性氧，以便能够切实提高家畜冷冻精液的质量。但是，众多研究发现，家畜冷冻精子超微结构的变化基本发生在解冻期，而冷冻状态下精子的质膜、顶体以及线粒体结构基本正常。因此，进一步探索在家畜冷冻精液稀释液中添加适宜的抗氧化剂，探讨其作用机理，对进一步提高冷冻精液的质量具有非常重要的意义[33]。

虽然抗氧化剂在家畜精液冷冻保存中的应用对于提高精子质量作用显著，但目前不同报道的抗氧化剂尤其是维生素类抗氧化剂在家畜精液冷冻保存中应用结果不尽一致，还需要进一步深入探究和分析。另外，大多研究主要集中于单独加入抗氧化剂的研究方面，很少涉及不同抗氧化剂联合在家畜精液冷冻保存中的应用，同时关于各抗氧化剂是否有协同作用研究也较少，特别是维生素类和酶类抗氧化剂的联合应用，应该加大不同抗氧化剂联合应用，以便更好的改善冷冻解冻后精子质量。因此，在家畜精液冷冻保存技术的优化方案尤其是稀释液配方的配伍上，应深入开展具有良好抗氧化作用的抗氧化剂方面的研究，这是今后家畜精液冷冻保存研究中值得重视的主要环节之一。

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