虫类中药蛴螬中含氮化合物研究

李 林，晏永明，李小年，钟惠民，程永现*

1中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室，昆明650204;2青岛科技大学化学与分子工程学院，青岛266042

昆虫是自然界种类最为丰富的物种，药用昆虫更以其独特的疗效而被广泛地应用于临床。蛴螬为节肢动物门昆虫纲鞘翅目金龟子科昆虫朝鲜黑金龟子Holotrichia diomphalia等同属近缘昆虫的干燥幼体，具有破血逐淤，明目退翳的功效，内服可用于妇女经闭、癥瘕等顽症痼疾，外用可治丹毒、痈疽、痔漏、跌打损伤等［1］。现代临床上有人将蛴螬制成滴眼液，用于治疗白内障、眼角膜翳的治疗，效果显著［2］。现代药理研究证明蛴螬具有抗肿瘤、保肝、抗菌等作用，如蛴螬石油醚提取物可诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡，蛴螬具有保肝作用等。相对于蛴螬突出的临床疗效，蛴螬的化学成分研究却极为薄弱，虽然有报道称蛴螬含有脂肪酸类、氨基酸、多肽或蛋白质、糖类、生物碱、有机酸盐、甾体化合物等，也有学者通过GC-MS分析表明蛴螬石油醚提取物含有反油酸、十六酸，硬脂酸等［3］，但由于这些成分一般是动物类中药均含有的共性成分，因此至今人们对蛴螬的化学成分，尤其是小分子物质认识仍然严重不足。我们为了揭示蛴螬药用的化学物质基础，对该中药进行了深入系统的研究，从其乙醇提取物中分离得到13个含氮化合物，经谱学方法鉴定其结构为 N-［2-(4-羟苯基)-乙基］乙酰胺、环(酪氨酸-脯氨酸)、吡啶-3-甲酰胺、胸苷、戊内酰胺、5-(羟甲基)-1H-吡咯-2-醛、环(脯氨酸-缬氨酸)、环(脯氨酸-丙氨酸)、羟吲哚、1，2，3，4-四氢-1，3，4-三氧-(-咔啉、吲哚-3-醛、黄苷和苯基丙氨酸，以上化合物均为首次从该种动物药中分离得到。

1 仪器与材料

核磁共振波谱用 Bruker AM-400和Bruker Avance-600核磁共振仪测定，TMS作为内标;ESIMS用Bruker HCT Esquire 3000离子阱质谱仪;高效液相色谱仪型号为 Agilent 1200;薄层层析硅胶GF254和柱层析硅胶(200～300目)均为青岛海洋化工厂产品;大孔吸附树脂为天津海光化工有限公司D101树脂;Sephadex LH-20为Pharmacia公司产品;反相硅胶RP-18和MCI gel CHP 20P分别为Daiso公司和三菱公司产品。

2 提取与分离

蛴螬(18 kg)购自安徽省亳州药材交易中心，经湖南中医药大学中药鉴定教研室周小江副教授鉴定为朝鲜黑金龟子(Holotrichia diomphaliaBates)的干燥幼虫，将药材粉碎后用95%乙醇冷浸提取三次，每次3 d，减压回收溶剂得浸膏2 kg，加水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。乙酸乙酯萃取物55 g经过反复硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析、MCI胶柱层析和反相柱层析，从中分得化合物1(130 mg)和2(4 mg)。正丁醇萃取物76 g经过反复D101大孔吸附树脂柱层析、硅胶柱层析、反相柱层析、MCIgel CHP 20P柱层析和Sephadex LH-20柱层析，从中分得化合物3(8 mg)和4(6 mg)。浓缩水相部分得浸膏740 g，取其一半370 g进行分离，经硅胶柱层析(氯仿∶甲醇15∶0～4∶1梯度洗脱)，分为三部分EQ-1-EQ-3，经过反复MCI gel CHP 20P柱层析、Sephadex LH-20柱层析、反相柱层析、硅胶柱层析及HPLC纯化，从EQ-1部分得到化合物1(30 mg)、2(6 mg)、5(6 mg)、6(1 mg)、7(4 mg)、8(11 mg)、9(2 mg)、10(2 mg)和11(10 mg);从 EQ-2部分得到化合物4(11 mg);从EQ-3部分得到化合物12(3 mg)和13(9 mg)。

3 结构鉴定

N-［2-(4-羟苯基)-乙基］乙酰胺 1 无色晶体;1H NMR(400 MHz，C5D5N):δH7.23(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)，7.15(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)，3.69(2H，m，H-7)，2.92(2H，m，H-8)，2.09(3H，s，H-10);13C NMR(100 MHz，C5D5N):δC170.6(s，C-9)，157.5(s，C-4)，130.6(s，C-1)，130.5(d，C-2，6)，116.4(d，C-3，5)，42.0(t，C-8)，35.6(t，C-7)，23.2(q，C-10)。以上数据与文献数值相符［4］。

环(酪氨酸-脯氨酸)2 无色晶体;1H NMR(400 MHz，Acetone-d6):δH8.33(1H，br s，HN)，7.15(2H，d，J=8.4 Hz，H-12，16)，6.75(2H，d，J=8.4 Hz，H-13，15)，6.59(1H，br s，OH)，4.30(1H，dd，J=11.2，5.6 Hz，H-3)，4.09(1H，t，J=7.6 Hz，H-6)，3.50(1H，m，H-9)，3.36(1H，m，H-9')，3.21(1H，dd，J=14.4，4.5 Hz，H-10)，2.90(1H，dd，J=14.4，7.1 Hz，H-10')，2.04(1H，m，H-7)，1.84(2H，m，H-7'，8)，1.66(1H，m，H-8');13C NMR(100 MHz，Acetone-d6):δC169.8(s，C-2)，165.9(s，C-5)，157.2(s，C-14)，131.6(d，C-12，16)，128.4(s，C-11)，116.0(d，C-13，15)，59.5(d，C-6)，57.2(d，C-3)，45.5(t，C-9)，36.2(t，C-10)，28.9(t，C-7)，22.9(t，C-8)。以上数值与文献数值相符［5］。

吡啶-3-甲酰胺 3 白色粉末;1H NMR(400 MHz，CD3OD):δH9.01(1H，m，H-6)，8.68(1H，m，H-3)，8.28(1H，m，H-4)，7.54(1H，m，H-5);13C NMR(100 MHz，CD3OD):δC169.8(s，C-7)，152.8(d，C-2)，149.4(d，C-6)，137.3(d，C-4)，131.4(s，C-3)，125.1(d，C-5)。以上数值与文献数值相符［6］。

胸苷 4 白色粉末;ESI-MSm/z:307［M+Na］+.1H NMR(400 MHz，CD3OD):δH7.82(1H，d，J=1.0 Hz，H-6)，6.28(1H，t，J=6.9 Hz，H-1')，4.40(1H，dd，J=5.9，3.4 Hz，H-3')，3.90(1H，dd，J=6.7，3.3 Hz，H-4')，3.76(2H，m，H-5')，2.22(2H，m，H-2')，1.88(3H，d，J=1.0 Hz，H-7);13C NMR(100 MHz，CD3OD):δC166.4(s，C-4)，152.4(s，C-2)，138.2(d，C-6)，111.5(s，C-5)，88.8(d，C-1')，86.2(d，C-3')，72.2(d，C-4')，62.8(t，C-5')，41.2(t，C-2')，12.4(q，C-7)。以上数值与文献数值相符［7］。

戊内酰胺 5 白色粉末;1H NMR(600 MHz，CD3OD):δH4.71(1H，s，NH)，3.30(2H，m，H-6)，2.33(2H，m，H-3)，1.82(2H，m，H-4)，1.79(2H，m，H-5);13CNMR(150 MHz，CD3OD):δC175.0(s，C-2)，43.0(t，C-6)，32.0(t，C-3)，23.0(t，C-5)，21.7(t，C-4)。以上数值与文献数值相符［8，9］。

5-(羟甲基)-1H-吡咯-2-醛 6 无色胶状物;1H NMR(600 MHz，CD3OD):δH9.26(1H，s，CHO)，6.87(1H，d，J=3.7 Hz，H-3)，6.16(1H，d，J=3.7 Hz，H-4)，4.50(2H，s，CH2OH);13C NMR(150 MHz，CD3OD):δC180.6(s，CHO)，143.4(s，C-5)，134.0(s，C-2)，124.8(s，C-3)，110.4(d，C-4)，57.8(t，CH2OH)。以上数值与文献数值相符［10］。

环(脯氨酸-缬氨酸)7 无色晶体;1H NMR(400 MHz，CDCl3):δH5.90(1H，br s，NH)，4.08(1H，t，J=7.4 Hz，H-6)，3.94(1H，s，H-3)，3.62(1H，m，H-9)，3.55(1H，m，H-9)，2.63(1H，m，H-1')，2.37(1H，m，H-7)，2.04(2H，m，H-7，8)，1.91(1H，m，H-8)，1.06(3H，d，H-2')，0.91(3H，d，H-3');13C NMR(100 MHz，CDCl3):δC170.0(s，C-5)，164.7(s，C-2)，60.3(d，C-6)，58.8(d，C-3)，45.1(t，C-9)，28.5(t，C-7)，28.3(d，C-1')，22.3(t，C-8)，19.2(q，C-2')，16.0(q，C-3')。以上数值与文献数值相符［11］。

环(脯氨酸-丙氨酸)8 无色晶体;1H NMR(400 MHz，CDCl3):δH6.62(1H，br s，NH)，4.06(2H，m，H-3，6)，3.62(1H，m，H-9)，3.51(2H，m，H-9)，2.28(1H，m，H-7)，2.03(1H，m，H-7)，1.96(1H，m，H-8)，1.85(1H，m，H-8)，1.41(3H，d，H-1');13C NMR(100 MHz，CDCl3):δC170.4(s，C-5)，166.4(s，C-2)，59.2(d，C-6)，51.1(d，C-3)，45.4(t，C-9)，28.1(t，C-7)，22.7(t，C-8)，15.9(q，C-1')。以上数值与文献数值相符［12］。

羟吲哚 9 白色粉末;1H NMR(600 MHz，CDCl3):δH7.59(1H，br s，NH)，7.15(2H，m，H-6，7)，6.96(1H，t，J=7.5 Hz，H-5)，6.80(1H，d，J=7.5 Hz，H-4);13C NMR(150 MHz，CDCl3):δC176.9(s，C-2)，142.1(s，C-7a)，128.0(d，C-6)，125.3(s，C-3a)，124.9(d，C-4)，122.4(d，C-5)，109.5(d，C-7)，36.1(t，C-3)。以上数值与文献数值相符［13］。

1，2，3，4-四氢-1，3，4-三氧-β-咔啉 10 黄棕色粉末;1H NMR(600 MHz，C5D5N):δH8.53(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，7.78(1H，d，J=8.0 Hz，H-8)，7.50(1H，t，J=8.0 Hz，H-7)，7.45(1H，d，J=8.0 Hz，H-6);13C NMR(150 MHz，C5D5N):δC172.1(s，C-4)，161.5(s，C-1)，160.2(s，C-3)，139.4(s，C-13)，137.3(s，C-10)，127.7(d，C-7)，125.2(d，C-6)，125.0(s，C-12)，123.3(d，C-5)，117.9(s，C-11)，114.9(d，C-8)。以上数值与文献数值相符［14］。

吲哚-3-醛 11 白色粉末;1H NMR(400 MHz，CD3OD):δH9.88(1H，s，H-10)，8.15(1H，d，J=7.3 Hz，H-5)，8.10(1H，s，H-2)，7.47(1H，d，J=8.0 Hz，H-8)，7.26(2H，m，H-6，7);13C NMR(100 MHz，CD3OD):δC187.4(s，C-10)，139.7(d，C-2)，138.0(s，C-9)，126.1(s，C-4)，125.0(d，C-5)，123.6(d，C-6)，122.4(d，C-7)，116.7(s，C-3)，113.1(d，C-8)。以上数值与文献数值相符［15，16］。

黄苷12 白色粉末;ESI-MSm/z:166［M+H］+，188 ［M+Na］+.1H NMR(600 MHz，D2O):δH7.76(1H，s，H-8)，5.72(1H，d，J=6.3 Hz，H-1')，4.22(1H，dd，J=5.0，3.2 Hz，H-2')，4.07(1H，d，J=2.9 Hz，H-3')，3.71(1H，dd，J=12.8，2.7 Hz，H-4')，3.63(1H，d，J=12.8，3.5 Hz，H-5');13C NMR(150 MHz，D2O):δC157.6(s，C-6)，150.9(s，C-2)，139.1(s，C-4)，135.8(s，C-8)，115.8(s，C-5)，87.6(d，C-1')，85.4(d，C-4')，73.2(d，C-2')，70.5(d，C-3')，61.3(t，C-5')。以上数值与文献数值相符［17］。

苯基丙氨酸13 白色粉末;ESI-MSm/z:265［M+Na］+.1H NMR(600 MHz，D2O):δH7.23(2H，m，H-3'，5')，7.18(1H，m，H-4')，7.13(2H，m，H-2'，6')，3.72(1H，m，H-2)，3.04(1H，m，H-3)，2.89(1H，m，H-3);13C NMR(150 MHz，D2O):δC174.7(s，C-1)，137.6(s，C-1')，130.6(d，C-3'，5')，130.1(d，C-2'，6')，128.5(d，C-4')，57.8(d，C-2)，38.8(t，C-3)。以上数值与文献数值相符［18］。

1 Yang CL(杨仓良)，Qi JY(齐杰英)．Herbal Animals(动物本草)1stEd．Beijing:Chinese Ancient Books Publishing House，2001．915-916．

2 Yang CM(阳长明)，Hou SX(侯世祥)，Luo JY(罗杰英)，et al．Study on preparation procedure of grub eye drops．Chin Trad PatentMed(中成药)，2001，23:235-237．

3 Dong QF(董庆峰)，Zhang CX(张崇禧)Zhang SF(张书锋)，et al．The chemical constituents fromHolotrichia diomphaand its pharmacological research progress．JPharm Prac(药学实践杂志)，2008，26:14-16．

4 Zhang BH(张炳火)．Chemical studies on the solid fermentation products of actinomycete JXJ-45．Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2008，20:650-651．

5 Angels NA，Villavicencio F，Guadarrama C，et al．Amino acid derivatives from the marine spongeJaspis digonoxea．J Nat Prod，1994，57:829-832．

6 Rudi A，Kashman Y，Benayahu Y，et al．Novel synthesis of primary arylamides from arylmethyl ketone oxidations using iodine in aqueous ammonia．JBraz Chem Soc，2010，21:905-908．

7 Peng JP(彭军鹏)，Qiao QY(乔艳秋)，Yao XS(姚新生)．Nitrogen-containing compounds fromAlliummacrostmonBunge．andAllium chineseG．Don．Chin JMed Chem(中国药物化学杂志)，1995，5:134-139．

8 Abraham RJ，Byrne JJ，Griffiths L，et al．1H chemical shifts in NMR:Part 23，+the effect of dimethyl sulphoxideversuschloroform solventon1H chemical shifts．Magn Reson Chem，2006，44(5):491-509．

9 Rong GB(荣国斌)，Zhu SZ(朱士正)．Structure Determination of Organic Compounds Tables of Spectral Data(波谱数据表—有机化合物的结构解析)Chinese Translation．Shanghai:East China University of Science and Technology Press，2002．141．

10 Sudhakar G，Kadam VD，Bayya S，et al．Total synthesis and stereochemical revision of acortarins A and B．Org Lett，2011，13:5452-5455．

11 Tezuka Y，Huang Q，Kikuchi T，et al．Studies on themetabolites of mycoparasitic fungi．I．Metabolites ofCladobotryum varium．Chem Pharm Bull，1994，42:2612-2617．

12 Ding ZT(丁中涛)，Bao ZJ(保志娟)，Yang XQ(杨雪琼)，et al．Three cyclic dipeptides from the root ofPsammosilene tunicoides．Chin J Chin Mat Med(中国中药杂志)，2003，28:337-339．

13 Motoyama Y，Kamo K，Nagashima H．Catalysis in polysiloxane gels:platinum-catalyzed hydrosilylation of polymethylhydrosiloxane leading to reusable catalysts for reduction of nitroarenes．Org Lett，2009，11:1345-1348．

14 Koike K，Ohmoto T，Ikeda K．β-Carboline alkaloids fromPicrasma quassioides．Phytochemistry，1990，29:3060-3061．

15 Nakajima E，Nakano H，Yamada K，etal．Isolation and identification of lateral bud growth inhibitor，indole-3-aldehyde，involved in apical dominance of pea seedlings．Phytochemistry，2002，61:863-865．

16 Gong YH(龚运淮)，Ding LS(丁立生)．13C NMR Analysis of Natural Products(天然产物核磁共振碳谱分析)2stEd．Kunming:Yunnan Science and Technology Press，2005．735．

17 Poznanski J，Kierdaszuk B，Shugar D．Structural properties of the neutral and monoanionic forms of xanthosine，highly relevant to their substrate properties with various enzyme systems．Nucleosides，Nucleotides and Nucleic Acids，2003，22:249-263．

18 Tian J，Yin Y，Sun H，et al．Magnesium chloride:an efficient13C NMR relaxation agent for amino acids and some carboxylic acids．JMagn Reson，2002，159:137-144．