链霉菌YIM69228发酵液中化学成分的研究

周 皓，杨亚滨*，刘 运，彭天凤，赵立兴，徐丽华，丁中涛

1云南大学化学科学与工程学院;2云南大学云南省微生物研究所，昆明650091

链霉菌具有代谢途径复杂，代谢产物种类繁多，产生的活性代谢产物多等特点，是产生在医药、农业、食品等领域具有重要意义的天然次生代谢产物的主要来源。近年来，对微生物代谢产物的研究日益增多，尤其是从链霉菌中寻找新药先导化合物仍是目前相关研究的重要方向，许多具有生理活性或新颖结构的化合物从链霉菌中分离得到［1，2］。

链霉菌YIM69228是由云南省微生物研究所从云南省西双版纳豆腐渣果(Helicia nilagirica)中分离得到的一株链霉菌。通过抗菌活性筛选发现其对五种植物病原菌茄腐镰刀菌，尖孢镰刀菌，玉米小斑病菌，炭疽杆菌，丝核菌有一定的抗菌活性，我们对其发酵液进行了化学成分研究，共分离得到10个化合物，(S)-2-羟基-3-(4-甲氧基苯基)-丙酸(1)，异莨菪亭(2)，N-苯乙基乙酰胺(3)，肉桂酸(4)，丁二酸单甲酯(5)，3，4-二羟基苯甲酸(6)，海藻糖(7)，吐叶醇(8)，Citroside A(9)，苄基-β-D-吡喃木糖基-(1″-6')-β-D-吡喃葡萄糖苷(10)。首次鉴定了天然产物化合物1的构型，其中化合物8～10为首次从链霉菌属放线菌中分离得到。

1 实验部分

1．1 仪器和材料

Bruker DRX-500 MHz型核磁共振仪(TMS为内标);Agilent G3250AA spectrometer质谱仪;薄层色谱硅胶板和200～300目柱色谱硅胶(青岛海洋化工厂);Sephadex LH-20(瑞典 GE HeaLthcare Bio-Sciences AB公司);Diaion HP20(日本三菱化学株式会社)。

1．2 菌种的培养

1．2．1 菌株

菌株YIM69228由云南大学云南省微生物研究所徐丽华研究员鉴定为链霉菌(Streptomycessp．)。菌株样品保存于云南大学微生物研究所。

1．2．2 培养基

培养基:马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，CaCO30．2 g，MgSO40．2 g，定容至 1 L，pH 7。发酵培养条件:10%的接种量，500 mL三角瓶装液量90 mL，200 rpm，28℃摇瓶培养6～7 d。

1．3 提取分离

菌株采用上述培养基发酵得发酵液40 L，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并后得到发酵液乙酸乙酯提取浸膏10 g。经硅胶柱色谱分离，氯仿/甲醇(1∶0-0∶1)梯度洗脱，得到四个部分(Fr．l～4)。Fr．1经过反复硅胶柱色谱，石油醚/乙酸乙酯(20∶1-0∶1)洗脱得到化合物 2(4．2 mg)，3(2．8 mg)，4(5．3 mg)。Fr．2分别经Sephadex LH-20柱色谱(甲醇洗脱)及反复硅胶柱色谱，氯仿/甲醇(20∶1-5∶1)洗脱得到化合物1(1．5mg)，5(5．7mg)，6(2．5mg)。水相再经大孔树脂(Diaion HP20)柱色谱，甲醇/水(0∶1-1∶0)洗脱，得到甲醇部分浸膏4 g。经Sephadex LH-20柱色谱(甲醇洗脱)及反复硅胶柱色谱，氯仿/甲醇(10∶1-2∶1)洗脱都得到化合物 7(65．7 mg)，8(5．3 mg)，9(4．2 mg)，10(5．4 mg)。

2 结果与讨论

化合物 1 无色油状，［α］25D:-19．3(c0．1，甲醇)。分子式为 C10H12O4。ESI-MSm/z:195［MH］-。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.07(2H，d，J=8.1 Hz，H-5，9)，6.76(2H，d，J=8.1 Hz，H-6，8)，4.42(1H，dd，J=7.3，4.2Hz，H-2)，3.78(H，s，MeO)，3.05(1H，dd，J=14.3，4.2Hz，H-3a)，2.92(1H，dd，J=14.3，7.3Hz，H-3b);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:175.0(C-1)，155.0(C-7)，131.1(C-5，C-9)，128.8(C-4)，115.7(C-6，C-8)，71.8(C-2)，52.8(MeO)，40.1(C-3)。与文献报道的2-羟基-3-(4-甲氧基苯基)-丙酸的核磁数据［3］基本一致，但文献中只报道了它的平面结构，通过旋光比对化合物1［α］25D:-19.3(c0.1，MeOH)与 Brenna 等［4］通过酶催化合成得到的(S)-2-羟基-3-(4-甲氧基苯基)-丙酸［α］25D:-9.6(c1.03，EtOH)基本一致，因此鉴定化合物1为(S)-2-羟基-3-(4-甲氧基苯基)-丙酸。

化合物2 白色粉末，分子式为C10H8O4。ESIMSm/z:193［M+H］+。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.59(d，J=9.5 Hz，H-4)，6.92(s，H-8)，6.85(s，H-5)，6.27(d，J=9.5 Hz，H-3)，3.96(s，MeO);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:161.7(C-2)，150.7(C-9)，150.1(C-6)，144.1(C-7)，143.6(C-4)，113.4(C-3)，111.9(C-10)，108.0(C-5)，103.6(C-8)，56.8(MeO)。以上数据与文献报道的异莨菪亭数据基本一致［5］。

化合物3 白色粉末，分子式为 C10H13NO。ESI-MSm/z:164 ［M+H］+。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.31-7.18(5H，m，H-Ar)，5.48(1H，brs，NH)，3.52(2H，m，H-8)，2.81(2H，m，H-7)，1.94(3H，s，Me);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:170.0(CO)，138.9(C-1)，128.8(C-3，5)，128.7(C-2，6)，126.6(C-4)，40.7(C-8)，35.7(C-7)，23.3(Me)。以上数据与文献报道［6］的N-苯乙基乙酰胺数据基本一致。

化合物4 白色粉末，分子式为C9H8O2。ESIMSm/z:149 ［M+H］+。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.61(1H，d，J=16.2Hz，H-7)，7.43(2H，m，H-2，6)，7.33(3H，m，H-3，4，5)，6.41(1H，d，J=16.2 Hz，H-8);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:176.8(C-9)，150.8(C-7)，137.6(C-1)，131.8(C-3，5)，131.3(C-2，6)，128.7(C-4)，119.9(C-8)。以上数据与文献报道［7］基本一致，确定化合物4为肉桂酸。

化合物5 无色油状，分子式为C5H8O4。ESIMSm/z:131 ［M-H］-。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:3.73(3H，s，MeO)，2.65-2.72(4H，m，H-2，3);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:177.7(C-4)，172.6(C-1)，51.9(MeO)，28.9(C-3)，28.6(C-2)。以上数据与文献报道［8］基本一致，确定化合物5为丁二酸单甲酯。

化合物6 黄色粉末，分子式为C7H6O4。ESIMSm/z:153 ［M-H］-。1H NMR(MeOD，500 MHz)δ:7.25(1H，d，J=2.8Hz，H-2)，7.19(1H，dd，J=8.9，2.8 Hz，H-6)，6.71(1H，d，J=8.9 Hz，H-5);13C NMR(MeOD，125 MHz)δ:169.8(C-7)，151.8(C-4)，146.9(C-3)，122.1(C-6)，122.0(C-1)，117.6(C-2)，116.5(C-5)。以上数据与文献报道［9］基本一致，确定化合物6为3，4-二羟基苯甲酸。

化合物7 无色柱状结晶，分子式为C12H22O11。ESI-MSm/z:343［M+H］+。1H NMR(D2O，500 MHz)δ:5.88(1H，s)，4.78(1H，m)，4.59(1H，m)，4.35(1H，m)，4.24(1H，m)，4.08(2H，m);13C NMR(D2O，125 MHz)δ:94.9(d)，74.2(d)，73.9(d)，73.5(d)，71.9(d)，62.2(t)。以上数据与文献报道［10］基本一致，确定化合物7为海藻糖。

化合物8 黄色针状结晶，分子式为C13H20O3。ESI-MSm/z:225 ［M+H］+。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:5.92(1H，m，H-4)，5.85(1H，m，H-7)，5.81(1H，m，H-8)，4.42(1H，m，H-9)，2.46(1H，d，J=17.1 Hz，H-2a)，2.25(1H，d，J=17.1Hz，H-2b)，1.91(3H，s，H-11)，1.31(3H，d，J=6.3Hz，H-10)，1.10(3H，s，H-12)，1.03(3H，s，H-13);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:199.2(C-3)，163.9(C-5)，136.8(C-8)，130.1(C-7)，128.0(C-4)，80.2(C-6)，69.2(C-9)，50.8(C-2)，42.3(C-1)，25.2(C-13)，24.8(C-10)，24.0(C-12)，20.0(C-11)。以上数据与文献报道［11］基本一致，确定化合物8为吐叶醇。

化合物9 白色针状结晶，分子式为C19H30O8。ESI-MSm/z:409 ［M+Na］+。1H NMR(MeOD，500 MHz)δ:5.92(1H，s，H-8)，4.54(1H，d，J=7.8 Hz，H-1')，4.35(1H，m，H-3)，3.83(1H，d，J=11.5 Hz，H-6'a)，3.63(1H，dd，J=11.5，5.3 Hz H-6'b)，3.16-3.37(4H，m，H-2'-5')，2.51(1H，d，J=12.4Hz，H-4a)，2.22(3H，s，H-10)，1.94(1H，d，J=11.5 Hz，H-2a)，1.49(3H，s，H-13)，1.40(3H，s，H-12)，1.33(2H，m，H-2b，4b)，1.18(3H，s，H-11);13C NMR(MeOD，125 MHz)δ:213.4(C-9)，201.1(C-7)，119.5(C-6)，101.8(C-8)，99.1(C-1')，79.2(C-5)，79.0(C-3')，78.2(C-5')，75.7(C-2')，72.2(C-4')，64.2(C-3)，63.3(C-6')，50.3(C-2)，48.5(C-4)，37.5(C-1)，32.9(C-11)，30.5(C-12)，27.1(C-13)，27.0(C-10)。以上数据与文献报道［12］基本一致，并通过二维NMR归属了碳氢谱，确定化合物9为Citroside A。

化合物10 黄色针状结晶，分子式为C18H26O10。ESI-MSm/z:401 ［M-H］-。1H NMR(MeOD，500 MHz)δ:7.28 ～7.45(5H，m，H-Ar)，4.93(1H，d，J=11.5 Hz，H-7a)，4.68(1H，d，J=11.5 Hz，H-7b)，4.38(1H，d，J=7.8Hz，H-1')，4.36(1H，d，J=6.9 Hz，H-1″);13C NMR(MeOD，125 MHz)δ:139.5，129.6，129.5，129.1(C-Ar)，105.6(C-1″)，103.8(C-1')，78.4(C-3')，77.9(C-5')，76.5(C-3″)，74.6(C-2″)，74.4(C-2')，72.4(C-7)，72.2(C-4″)，71.1(C-4')，69.9(C-6')，67.1(C-5″)。以上数据与文献报道［13］基本一致，确定化合物10为苄基-β-D-吡喃木糖基-(1″-6')-β-D-吡喃葡萄糖苷。

1 Lewis K，Epstein S，D'Onofrio A，et al．Uncultured microorganisms as a source of secondary metabolites．J Antibiot，2010，63:468-476．

2 Demain AL，Sanchez S．Microbial drug discovery:80 years of progress．JAntibiot，2009，62:5-16．

3 Siddiqui BS，Perwaiz S，Begum S．Studies on the chemical constituents of the fruits ofCordia latifolia．Nat Prod Res，2006，20:131-137．

4 Brenna E，Fuganti C，Gatti FG，et al．Enzyme-mediated synthesis of EEHP and EMHP，useful pharmaceutical intermediates of PPAR agonists．Tetrahedron:Asymmetry，2009，20:2594-2599．

5 Jerezanoa A，Jiménez F，Cruz MC，etal．New approach for the construction of the coumarin frame and application in the total synthesis of natural products．Helve Chim Acta，2011，94:185-198．

6 Taylor JE，Jones MD，Williams JM，et al．N-acyl DBN tetraphenylborate salts as N-acylating agents．JOrg Chem，2012，77:2808-2818．

7 Yang XD(羊晓东)，Mei SX(梅双喜)，Yang R(杨蓉)，et al．Study on the chemical constituents ofLagotis Yunnanesis．Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2002，14:1-3．

8 Sedelmeier J，Ley SV，Baxendale IR，et al．KMnO4-mediated oxidation as a continuous flow process．Org Lett，2010，12:3618-3621．

9 Chen YX(陈永胜)，Lin XY(林小燕)，Zhong LJ(钟林静)，et al．Chemical constituents ofVitex trifoliaL．．Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2011，23:1011-1013，1048．

10 Mao SC(毛绍春)，Li ZY(李竹英)，Li C(李聪)．Chemical constituents fromSchizophyllum commune．Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2007，19:610-613．

11 Peng B(彭冰)，He CN(何春年)，Xu LJ(许利嘉)，etal．三白草的化学成分研究．Chin Trad Herb Drug(中草药)，2010，41:1950-1952．

12 Umehara K，Hattori I，Miyase T，et al．Studies on the constituents of leaves ofCitrus unshiuMarcov．Chem Pharm Bull，1988，36:5004-5008．

13 Lee SY，Kim KH，Lee IK，et al．A new flavonol glycoside fromHylomecon vernalis．Arch Pharm Res，2012，35:415-421．