基于“谱-效”相关的中药药效物质基础研究方法

刘 莉，李文兰* ，丁晶鑫

1哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心;2国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，哈尔滨150076

药物学研究是自然科学研究领域中一门古老的学科，药物研究水平的优劣标志着一个国家医药和医疗科学水平的高低。随着药物现代化思维的发展，及现代医学理论对药物开发的影响，作为祖国医药学重要组成部分的“中药”日益受到重视，对中药防治疾病的物质基础即中药化学成分的研究和使用亦越来越广泛。中药之所以对疾病具有防控作用，其物质基础在于中药中所含有与治疗病症相关的有效成分。中药所具有的疗效是其中所含多种药效物质综合作用的结果，有其独特的理论体系和应用形式，对于中医药的研究，不能单以研究西方植物药的方法去阐明，还应考虑到中药是多组分多靶点及具有整合调节作用的特殊药物，因此对它的深入研究是使其现代化的关键和核心。

中药含有不同结构、不同性质的多种成分，其整体药效是其中所含的物质群整体作用的结果。近年来指纹图谱技术在业内已引起广泛关注并成为评价中药质量的重要手段，其特点是能够表征样品所含化学成分质的特征和量的大小以及中药的整体特征性［1，2］;从德国和法国联合开发的银杏叶标准制剂制定的标准中可以看出，对药物中的总黄酮和总内酯大类成分含量进行控制，同时亦对其指标成分间的比例进行了控制，并且通过色谱指纹图设置了内控鉴别，可以说国际上也在积极提倡通过指纹图谱对草药产品进行质量评价。然而并不能仅以指纹图谱中所表征的信息评价其质量的优劣，其局限性在于并不能够明确指纹图谱与其疗效是否具有相关性、所体现的化学成分是否代表药效活性成分。将中药指纹图谱中的化学成分的变化与其疗效评价相结合，研究其相关性，找出与药效活性相关的药效物质群，即“谱效关系”研究，目前成为探索中药特定药效物质基础的主要方法与手段。中药谱效关系研究中最关键的问题是如何将指纹图谱的“谱”与中药中的药“效”关联起来。通过谱效相关性研究所捕获的信息可以进一步阐明与其活性相关的主要活性成分。谱效关系研究是近几年被提出的，如何进行谱效相关性研究还未有统一模式，随着对中药药效物质基础研究的重视及探索，近些年关于运用谱效关系学进行药效物质基础研究的报道逐渐增多，现就以下几方面对中药谱效关系研究方法作一综述，为中药药效物质基础研究提供思路及参考。

1 中药谱效关系研究思路

中药谱效关系研究可以从三方面入手:多维联用技术分析、药效检测、信息处理;获取中药指纹图谱和药效数据结果;通过数学处理，建立谱-效数学模型，确定出与药效相关的成分群，用于质量评价［3］。谱效关系研究是将化学成分的研究与其药理研究结合，阐明其有效化学成分的整体疗效与其药效的相互关系。中药谱效相关研究与中药现代化密切相关，目前中药谱效学适宜的规律性研究思路为:通过对药物采取不同的制备方法，并根据其特性采用适合的分析方法［高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、液相色谱质谱联用(LC-MS)、气相色谱质谱联用(GC-MS)］，构建指纹图谱，获得多个化学成分;根据药物所具有的药效建立适合的药效模型，对药效模型给予药物，获得生物样本，对生物样本进行分析，获得生物指纹图谱及多个效应相关成分(包括原型及代谢成分);对所具有的效应成分进行溯源、组合、筛选，确定其主要成分及影响权重和对疗效的贡献率;通过数学模型处理，将药物与实验模型谱效进行关联，总结规律，建立谱效关系，从而获得药物谱效关系。

2 中药谱效相关性研究方法

2．1 基于指纹谱信息，进行药效学验证

中药谱效关系的研究建立于其指纹图谱研究基础之上，故谱效研究应通过采用适合的分析方法建立指纹图谱。目前在中药谱效关系研究中广泛采用的色谱方法包括高效液相色谱(HPLC)法、气相色谱(GC)法、色谱质谱联用技术等，通过此分析测试技术构建指纹图谱，其色谱峰面积体现了成分与药效之间的关系［4］。基于指纹图谱信息，从化学谱中选取有针对性的化学成分或成分群，对其进行药理学或药效学试验，进而研究化学成分及其组合成分的药理学效应，通过相关药理学效应研究寻找出代表总体药效的最佳成分及有效成分或有效部位。GC色谱常用来分析含有挥发性成分的药物谱效关系研究，如尹莲等［5］通过GC方法对加味四妙丸有效部位测定GC指纹图谱，并将指纹图谱各共有峰相对面积与药理学数据相关联，比较有效共有峰的变化特征，结果表明该指纹图谱谱效关系是表征复方整体成分-配伍-药效相关性的有效途径。色谱-质谱联用技术在谱效关系研究中主要用于指纹图谱色谱峰对应成分的鉴定，目前已广泛应用于中药生理活性及作用机制的进一步研究，如关枫［6］等采用GC-MS技术测定黑龙江产狭叶荨麻挥发油中的化学成分，并对其成分进行分离和鉴定，通过面积归一法确定相对含量，最终鉴定出87种化合物，为狭叶荨麻的资源开发和应用提供了科学依据。沈岚等［7］在研究芍药甘草效应谱效关系过程中，将给药后大鼠血清胃底肌条解痉实验获得的药效学信息，与各组含药血清HPLC指纹图谱化学信息进行谱效相关研究，采用HPLC-ESI-MS/MS对与药效呈正相关的4个色谱峰进行质谱鉴定，获得与药效相关的目标成分。

中药是一个复杂的体系，每一味药都是一个方剂，其中的化学组成并不能够通过单独某张HPLC图谱完整地表征出来。因此，对其研究需要引入多维指纹图谱(multi-dimensional fingerprinting)技术体系进行多维谱效关系研究，包括“多源指纹图谱”(multi-resource fingerprinting)与“多元指纹图谱”(multiple fingerprints)。目前，相关研究者对多维指纹图谱已经进行了探索研究。如Qi LW等通过DAD、ELSD 检测器，对黄芪［8］和含黄芪的中药制剂［9］中的黄酮及皂苷类成分进行同时分析;Yi L等［10］通过串联多种检测器，对“当归补血汤”中的皂苷类、黄酮类、有机酸类、挥发油类物质进行同时分析;Li YP 等［11］采用HPLC-DAD、GC-MS对中药红毛七中的多种类型生物碱进行了分析;范晓辉［12］等对复方丹参滴丸进行了多元指纹图谱技术分析，构建了方中丹参药材酚酸类成分及三七药材皂苷类成分的HPLC指纹图谱以及复方丹参滴丸的多元HPLC指纹图谱。通过多维谱效关系研究，可能解决中药的质量分析难题。

2．2 指纹图谱信息与药效学结合

将体外化学指纹图谱与药效学研究结合，通过以指纹图谱所表征的信息为指导，用药效学数据合理优化指纹图谱的建立。并通过指纹图谱与药效相关性分析，研究与该药物药效相关的目标化合物。如蛇床子在前期研究中发现其具有很强的镇静催眠作用，但仅限于药物整体作用，具体具有该作用的物质基础并不明确;有研究者通过对蛇床子不同溶剂提取物进行指纹图谱分析，确定了8个共有峰，并将各提取物灌胃小鼠，在最后一次给药60分钟后腹腔注射戊巴比妥钠进行镇静催眠测试，观察戊巴比妥钠对小鼠的持续睡眠时间，比较各提取物镇静催眠活性，通过指纹峰面积与持续睡眠时间的相关系数大小，推测出8个共有峰中的第5号峰与镇静催眠作用具有显著的相关性，综合分析确定5号峰为蛇床子起镇静作用的主要目标活性成分，为其下一步分离及结构鉴定打下基础［13］。陈华国等［14］采用HPLC法对虎杖不同极性提取物进行指纹图谱研究，并对其提取物进行抑菌作用及抗肿瘤作用研究，通过检测其生物活性指标，获得药效数据，采用灰关联度方法分析其谱效关系，结果表明与抑菌作用及抗肿瘤作用关联度较大的成分为黄酮类和蒽醌类成分;通过谱效相关性研究，对虎杖药效特征峰所表达的具体药效作用进行了初探，为最终获得化学成分信息和药效信息提供了可能，同时也为天然药物谱效关联的指纹图谱的建立提供了新的思路。

建立血清指纹图谱，根据含药血清的药理强度与其血清指纹图谱中的该成分指纹峰的大小进行比对，以此阐释该成分是否与药理作用相关。血清指纹图谱信息与血清药效进行相关分析，有别于体外指纹图谱与药效相关分析，排除了机体对药物体内代谢的影响，通过谱效研究能够直接获得体内活性物质，并用于探寻体内相关活性物质;将体外化学指纹图谱、血清药物化学指纹图谱和血清药理效应对比分析，建立谱效相关，是药效物质基础确定的有效手段，但是血清指纹图谱与血清药效学研究的时间控制点对试验结果有较大影响。

沈岚等［7］在对芍药甘草复方解痉活性成分研究中，通过灌胃SD大鼠不同配比的芍药苷、甘草酸、甘草总黄酮效应组分的混悬溶液，分别在给药后不同时间点采血，分离血清，获取芍药甘草体内成分血清特征图谱;同时制备大鼠胃底环行肌条，将效应组分配伍血清对胃底环行肌条进行胃底肌条解痉实验，通过测量收缩张力，获得各组抑制率，利用双变量相关分析处理血清指纹图谱与药效相关系数，通过谱效研究发现给药后在体内与解痉作用相关性较大的色谱峰有4个，由此获得体内活性物质，在此基础上对给药后的血清样品进行HPLC-ESI-MS/MS分析，确定了与药效相关性较大的入血成分，其主要是效应组分代谢成分，此项研究建立了体内生物活性物质谱效研究的新方法，同时也为探寻芍药甘草解痉作用的物质基础提供了有效的研究手段。郭承军等［15］将血清代谢研究结合色谱成分分析，获得与抗流感药效密切相关的成分峰，建立了相关谱效关系模型，奠定了金银花体内药效作用机理研究基础。

2．3 谱效相关数据处理技术

目前天然药物谱效关系的阐释依赖于数据分析方法，现阶段采用的数据处理方法并不统一，其主要数据处理法包括相关分析、聚类分析、回归分析(普通多元回归、偏最小二乘回归)、灰色关联度分析、主成分分析、图谱比对等多种分析方法，采用这些方法将指纹图谱与药效活性数据结合建立数学模型，研究二者的相关性，即得到“谱效关系”。由于每种方法都有其优点和不足，采用何种处理方法来研究谱效关系还需进一步研究和探讨［4］。

3 谱效相关在中药研究中的应用

3．1 在单味中药研究中的应用

中药单味药中将某一特定成分含量的多少作为评价该味中药的质量标准有一定的局限性，其成分含量的高低不能完全代表其质量优劣，在某些药效作用方面，其它的活性成分可能起着关键作用，其药理作用可能是多个成分的协同作用。因此，在建立指纹图谱过程中，需要考虑中药的各种药理药效，为全面评价某一单味药质量提供有力依据。

刘荣华等［16］以山楂叶为研究对象，针对其主要临床作用—抗冠心病作用，研究不同种山楂叶HPLC指纹图谱的各指纹峰，并进行抗大鼠PMN呼吸爆发药效实验，建立了各指纹峰峰面积与药效之间关系(峰效关系)的数学模型，通过数学、化学计量学、计算机编程与模拟等手段将山楂叶的HPLC指纹图谱翻译成生物活性指纹图谱(包括药效指纹图谱和效价指纹图谱)，为中药谱效关系研究提供了思路。

金银花具有明显的抗菌、抗病毒作用，郭承军等［15］以流感模型小鼠为研究对象，对小鼠灌胃金银花提取液，下腔腹主静脉取血并分离血清，进行血清指纹谱分析，将正常小鼠与流感模型小鼠的血清成分图谱进行比对，将血清代谢研究与色谱分析相结合，获得与抗流感药效密切相关的成分峰，此项研究建立了相关谱效关系模型，为金银花体内药效作用机制研究奠定了基础。

倪力军等［17］从丹参药材中提取纯化丹酚酸，构建9个丹酚酸样品，并建立相应HPLC指纹图谱，对各样品的抗氧化活性通过两个体外应激模型进行比较，将抗氧化活性与HPLC色谱图进行PLS回归分析［18］，对各样品中主成分的变化与抗氧化活性间的关系进行了考察，为控制丹参制剂的质量提供了依据。

板蓝根具有红细胞凝集作用，孙琴等［19］通过用红细胞凝集活性检测法对进行系统化学部位分离的板蓝根药材进行抗病毒活性的化学部位筛选，筛选出正丁醇萃取部位具有强红细胞凝集活性，针对正丁醇萃取部位建立了不同产地的10批样品的HPLC指纹图谱，同时进行生物效应测定，运用数理统计方法研究其谱效关系;谱效研究结果发现共有峰中的2号和11号的相对峰面积比例与样品凝集作用呈正相关，故推断板蓝根具有抗病毒作用的特征峰可能为2号和11号峰，此项研究为建立板蓝根具有抗病毒活性的谱效相关的质量控制模式提供了理论依据。

3．2 在中药复方研究中的应用

中药复方谱效关系研究常用的方法是将该全方作为药效，将全方用不同方法进行提取分离，所得到的各个部分进行色谱分析和药理实验，通过利用数学处理方法和计算机功能，找出色谱峰与药效之间的关系，将分离得到的各个部分通过正交分析法进行组合，再进行色谱分析及药理实验，再通过数学相关分析找出组合后的组分与药效相关性。中药复方配伍的研究方法是通过配伍变化产生药效学的差异来研究配伍机理;或是对药物全方的贡献通过指标性成分的变化来进行考察;或是采用指纹图谱技术对该药进行整体描述［20，21］。通过以上研究方法将化学成分群特征峰的指纹谱与药效结果相关联，探讨复方配伍规律。

中药复方具有多组分多靶点的整合调节作用，其谱效关系的建立能够反应复方的内在质量。中药血清药理学和血清药物化学两者的结合研究有助于中药药效物质基础的阐明。窦志华等［22］通过血清药理学及血清药物化学相结合探寻中药复方五仁醇胶囊的药效物质基础，实验研究中将复方五仁醇全方制剂含药血清、各单味制剂含药血清及拆方后的各组方药材阴性制剂进行HPLC测定和药效学评价。实验结果表明，复方五仁醇全方、单味五味子及缺三七、柴胡、叶下珠制剂的含药血清对肝损伤的保护作用明显，而缺单味三七、柴胡、叶下珠制剂的含药血清和缺五味子制剂的含药血清对肝损伤的保护作用不明显，同时单味五味子全方制剂的含药血清药效差异无显著性区别，具有很好的谱效相关性，最终确定君药五味子中含有的木脂素类成分为保肝作用的药效物质。

谱效关系研究是确定中药复方药效物质基础的有效手段，沈岚等［7］对芍药甘草复方谱效进行了探讨，通过给药后大鼠血清胃底肌条解痉实验获得的药效学信息，与各组含药血清HPLC指纹图谱化学信息进行谱效相关研究，采用HPLC-ESI-MS/MS对与药效呈正相关的4个色谱峰进行质谱鉴定，获得与药效相关的目标成分，并经质谱分析，确定了相关效应组分的代谢成分，获得了体内活性物质，为该中药复方活性成分的纯化奠定了基础。

建立中药谱效关系能够反映复方的内在质量，邓翀等［23］在已有三黄方制剂指纹图谱实验研究的基础上，对三黄方制剂进行体外抗内毒素活性作用研究，将抗内毒素活性作用研究结果与指纹图谱研究结果相关联，以寻找谱与效之间的相关性及科学规律。实验结果显示三黄方制剂中有6种成分与体外抗内毒素活性相关，提示可以以该6种成分为指标对三黄方制剂进行质量控制，此研究为三黄方制剂的药效评价提供了科学依据。

3．3 作为中药质量评价新模式

余伯阳等课题组提出了中药质量评价新模式［24］—“谱效整合指纹谱”概念，并对其开展深入研究。其课题组内常艳旭等［25］通过HPLC-DAD-CL联用技术对丹参注射液进行在线活性分析，分别构建活性指纹谱和效价指纹谱，将化学信息指纹谱和活性信息指纹谱结合分析，确定了野生丹参的替代品为栽培丹参和白花丹参。丁晓萍等［26，27］运用HPLC-DAD-MS-CL联用技术获得了不同淫羊藿药材的三维谱效整合指纹谱，使淫羊藿多种成分的MS结构鉴定和在线活性测定得以实现，构建了成分指纹谱与成分峰及药效相对应的表观形式，可以对中药质量进行综合评价，对中药质量评价体系具有补充完善作用。在线活性分析能够较好地完善“谱效整合指纹谱”研究，该方法在国外主要应用于食品分析领域，如 Toshimasa Toyo’oka 等［28］对茶叶中的抗氧化成分进行在线活性评价和分析等。

4 结语

目前天然药物谱效关系学研究方法存在着一定的局限性，还没有形成成熟稳定的研究思路和方法。谱效关系反映了药物内部各成分与药效之间的相关性，是数学相关分析与药学的交叉应用，体现的是某个组分与药效相关性的大小或是某个组分对药效更具影响。谱效关系研究目前还没有阐明复杂成分的协同作用，突破此项技术难点是中药现代化的关键所在。谱效相关研究需要进行学科交叉与创新，已有人对此提出了不同的思路:如李建新［29］、范骁辉［30］等分别提出将成分指纹图谱通过运用微流控芯片技术对其进行药效检测;及将多维特征图谱与通过体内、外计算机模拟而获得的多指标效应检测法构成的药效指标进行整合，从而获得多维药效特征图谱，此方法的提出展示了谱效关系研究将会引入前沿学科技术，其应用前景广泛，为谱效相关研究提供了新思路和新方法;余伯阳等介绍了通过引入在线活性分析联用技术，建立了成分分离与化学指纹信息获取以及活性检测同时进行的在线谱效整合体系，为中药谱效相关研究提供了一种可借鉴的新模式［21］。目前对中药药效物质基础研究并不深入，其谱效关系研究仅限于谱与效的相关性，缺乏对其药理活性的特征峰进行定性定量研究，随着分析技术水平的不断提高与创新，中药谱效关系研究必将更加深入，研究方法必将更加完善。

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