组织因子阳性微粒对血栓形成影响的研究进展

贺红庄 陈洪昌 张晶晶

组织因子阳性微粒对血栓形成影响的研究进展

贺红庄 陈洪昌 张晶晶

组织因子阳性微粒；血栓形成；影响；研究进展

血栓形成是心血管疾病发生的极高危影响因素，很容易发展为心血管疾病，严重影响了住院患者的生存时间和生活质量，因此血栓形成的原因一直是临床广泛关注的焦点。在众多的原因当中，组织因子阳性微粒是最近才被人们重视的一种生物学物质，对血栓形成很可能具有较强的促进作用。现将组织因子阳性微粒与血栓形成的相关性研究进展予以概述。

1 组织因子阳性微粒

1.1 组织因子阳性微粒的来源早在1946年，Chargaff和West两位学者发现血小板游离血浆中存在一种促进血栓形成的因素，但是首次提出循环微粒概念的学者是Woff，当时命名为“血小板粉尘”[1]。细胞凋亡和血管细胞活化的作用，促使组织因子阳性微粒的释放[2]，同时还来源于红细胞、单核细胞、血小板等。无核细胞（如血小板和红细胞）不进行典型的凋亡，但在激活状态下也易产生微粒，健康者血浆中80%以上来源于血小板，在病理状态下，红细胞、白细胞等可相对于生理状态下产生更多的微粒[9]。后来，学者们称其为“组织因子阳性微粒”、“促凝微粒”、“囊泡”等众多名称。微粒大小不等，直径波动在0.05～1.0微米之间，主要由蛋白质和脂类组成[1-3,7]。这种微粒在血液当中，构成了细胞损伤的可靠标志，当细胞损伤后在组织中保持为固态或是迅速呈递给吞噬细胞清除[2]，同时微粒促进了止血和炎症反应、血管重塑、血管生成、细胞生存、和细胞凋亡，这些过程都参与了动脉粥样硬化的形成[2-3]。健康人群的血液中若是促凝血微粒高水平往往与血栓形成有关系[2]。除了是细胞损伤的标志外，促凝血微粒在动脉粥样硬化进程中直接对血管和学细胞发挥作用。在病理情况下，循环微粒可能促进细胞间的相互作用导致血管炎和组织重构，内皮细胞功能紊乱，白细胞粘连和机体应激[2]。暴露膜磷酰氨酸和功能性组织因子，这两个促凝血物质传递给循环微粒，在血管损伤部位p-选择素激活血管内皮细胞或血小板暴露导致促凝血微粒迅速聚集，用促凝血微粒对抗p-选择素、糖蛋白配体-1、和血源性转移因子，因此引发血液凝固[3-4]。促凝微粒还可以刺激人脐静脉内皮细胞表达组织因子[5]。有趣的是，组织因子表达于血浆中的质膜组成的结合体就是组织因子阳性微粒，其形成是由于细胞膜不对称分布的磷脂在断裂的同时会以出牙的方式脱落形成的小泡状结构，静息细胞中，细胞质的小叶主要是由磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺构成，胞外小体主要是鞘磷脂和磷脂酰胆碱合成的，这些磷脂的分布是由氨基磷脂转位酶调控的，当细胞被激活后，通常是钙通道的激活伴随着酶控下磷脂酰丝氨酸异位，磷脂酰丝氨酸由质膜内层进入外层产生微粒，另外，血小板激活产生微粒的过程中，需要激活V11a、IXa、Va、和Xa凝血因子[11-13]。组织因子激活后从而启动外源性凝血系统，发生血液凝固，引发血栓形成。研究还发现，凝血微粒积聚后，激活X因子，启动内源性凝血系统，促进血栓级联放大作用[2,6]，最终导致体内血栓广泛形成。

1.2 组织因子的生物学特性对于活化的血小板，循环微粒提供了在促凝血磷脂表面形成的具有凝血级联作用的酶复合物。他们的催化性能依赖于凝血阴离子，氨基磷脂，氨基酸丝氨酸，易位外胞浆层后膜重塑。一旦进入血液循环的因子，氨基酸丝氨酸能使局部的凝血酶的浓度达到动力学需要的水平，凝血酶生成和有效的止血。事实上，屏蔽丰富的磷酯酰丝氨酸减轻催化效率分别是组织酶和凝血酶原复合物的200和1000倍。另外，磷酯酰丝氨酸大大提高了凝血活性因子，是细胞凝血的主要发起者[2]。同时，人们还发现并证明伴随着组织因子阳性微粒聚集的血小板形成是依赖于p-选择素糖蛋白配体1（P-selectin glycoprotein lingand-1, PSGL-1）[4]。Butenas等[14]发现，在正常人血浆中组织因子阳性微粒聚集不会激发体内血栓的形成，血小板激活也不会导致组织因子抗原活性增多。在病理状态下，如2型糖尿病患者组织因子阳性微粒的数目比健康者增加2倍以上[15]，还有研究发现[16]糖化血红蛋白水平欠佳的糖尿病患者体内组织因子阳性微粒促凝活性是上升的，糖尿病患者发生急性心肌梗死期间，血小板、内皮细胞、单核细胞源性的组织因子阳性微粒是增多的，可能是加重血管闭塞的原因。

1.3 组织因子阳性微粒标本的留取和保存血中微粒数目相关少，检测准备的标准化要求非常重要。实验检测前内容包括血样本的采集、分离和存储。分离又包括微粒悬液的离心和悬浮。抗凝剂的选择目前尚有争议，现在最常用的是枸橼酸钠，也有人认为抗凝剂可同样用来抗凝，其他可能影响是止血带导致静脉血瘀滞，存储微粒悬液温度和采集完成带检测之间的存储时间等。微粒是通过提取乏血小板血浆或血液超离心得到的，研究表明，经乏血小板血浆提取途径，40%的健康者通过流式检测不出组织因子微粒，另外，存储过程中微粒悬液冻融会给实验结果带来影响，数据表明磷酯酰丝氨酸表达annexin+在冻融的情况下表达提高了20倍，说明冻融可以促使微粒表面膜上磷酯酰丝氨酸向血浆中释放。

1.4 组织因子阳性微粒的检测目前研究检测血小板微粒的方法最多，其中流式细胞仪技术被认为是最普遍的手段，流式检测血小板微粒时通过锁定annexinv这一结合位点标志和血小板特异性抗原（CD41，CD42 CD61 CD62），这样可以有效地排除白细胞和红细胞源性微粒的干扰。Robert等通过流式实验实验证明，利用0.5微米和0.9微米荧光小球以2：1的比例设门，并锁定annexine和CD41两个标志，同一标本在不同时间检测出微粒数变异小，可重复性强。流式细胞仪缺点在于噪声环境下检测维兰德特异性和敏感性不足。其具体方法如下：①待测样本染色准备。a，每组样本取100微升，加入100微升HEPES离心液，暗室中加入10微升荧光抗体，暗室中温培育30min。4摄氏度密封保存过夜。b，样品加入4微升FITC-AnnexinV荧光抗体，暗室中培育30分钟。C，样品加入200微升HEPES离心液，吹打混匀。d，上机前每组样品准确加入6微升标准技术颗粒100微升，并轻吹打混匀。②样品检测和分析。a，每批次测量样本之前都需要用标准液进行控制和参数矫正。b，计数测量停止以P2门收集满10000个6微升标准计数颗粒为止。C，定义出现在p1门内，且FITC阳性的事件为膜微粒。其中同时有染色阳性的事件为组织因子阳性微粒。C，膜微粒及组织因子微粒的计数公式：N=E*96000/10000*600。E表示P1门中所有事件计数；96000为加入的100微升计数标准颗粒总数；10000为P2门记录的计数颗粒数；600为总稀释倍数。（注意：当流式细胞仪出现液流不稳时，需要调整参数后重新测定）

2 组织因子阳性微粒在血栓方面的研究

2.1 动脉粥样硬化性疾病组织因子阳性凝微粒是动脉粥样硬化的一个危险成分。血液循环当中高浓度的血小板，单核细胞，或内源性的促凝微粒与心血管的危险因素密切相关，这似乎暗示了不好的临床结果。除了是一个血管内皮细胞损伤的标志外，促凝微粒交叉性地在动脉粥样硬化进程直接对血管或血液细胞发挥作用。在病理环境下，循环促凝微粒可能促进细胞间相互交流导致血管炎症和组织重构，内皮细胞的功能紊乱，白细胞粘连和机体应激。暴露膜磷酯酰丝氨酸和功能行的组织因子，这两个促凝血单位传递给循环促凝微粒。在血管损伤部位，P-选择素激活的血管内皮细胞或血小板暴露导致促凝微粒迅速聚集，用组织因子阳性凝微粒来对抗P-选择素，糖蛋白配体-1和血源性的转移因子，因此引发血液凝固。在动脉粥样硬化板块中，聚集的促凝微粒构成了转移因子作用的主要场所，促进血液凝固后，板块侵蚀或破裂。损伤区域的促凝微粒，最终隐藏的水解蛋白和血管效应因子是在板块易损性中另加入的成分[2]。急性冠状动脉综合症中，随着内皮细胞的损失，因子触发冠状动脉粥样硬化形成。动脉粥样硬化板块中脱落细胞丰富的脂质是其核心部分。增强子活性直接被磷酯酰丝氨酸组织因子阳性微粒所支持。巨噬细胞凋亡构成了膜结合因子的主要来源，平滑肌细胞也能够水解。在斑块重塑的过程中，各种来源的促凝微粒能够调节血管生成，也是斑块脆弱性的一个关键因素。促凝微粒，有可能进入血栓斑块后局部血栓吞噬能够促进血管生成，然而促凝微粒能够加强氧化应激导致细胞凋亡。此外，促凝微粒活性还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的支持物（NADPH），并且参与活性氧介导内皮细胞或平滑肌细胞的凋亡。凋亡的淋巴细胞源性微粒可以阻止内皮源型一氧化碳的合成，这是通过抑制一氧化碳合酶表达来实现的，从而导致内皮细胞凋亡。

2.2 免疫介导的血栓性疾病在“免疫介导的后天获得性血栓性疾病”例如抗磷脂综合症和肝素诱导的血小板减少综合症，自身抗体可能有助于释放组织因子阳性微粒，抗磷脂综合症的一个共同特点就高浓度水平的促凝血微粒，现在仅仅在全身性系统红斑狼疮患者体内发现了抗磷脂抗体。系统性红斑狼疮患者的血栓形成倾向与组织因子阳性微粒成很强的正相关。对抗磷脂综合症患者的血浆样本化验发现其中的内皮细胞具有促进组织因子阳性微粒释放的作用，说明具有抗磷脂抗体的作用。于此相反，平在系统性红斑狼疮患者体内微粒的高水与抗磷脂抗体的产生或疾病的演变没有直接关系。肝素诱导的血小板减少综合症一个常见的原因是药物相关的免疫介导的血小板减少症，更有害于血栓素的体制的人。肝素诱导的血小板减少症患者进一步促进了抗体抗循环肝素血小板因子-4（PF-4）复合物，导致血小板活化交联。自动释放组织因子阳性微粒暴露适配器，GPIIb IIIa，P-选择素，血小板和高水平的血栓素发挥聚集效力从而激活凝血系统。另外，组织因子阳性微粒结合内皮下基质，这就进一步促进更多的血小板复合物聚集组成组织因子阳性微粒池。

2.3 静脉血栓性疾病Zwicker发起一个随机对照的实验，评价高表达的组织因子阳性微粒的易栓性，并命名为microTEC研究[17]。癌症患者但没有静脉血栓史接受入组，在4周内他们接受一线或二线抗肿瘤治疗，对患者和医生采用双盲法，用抗阻流式测组织因子阳性微粒，组织内因子阳性微粒高的被随机予以低分子肝素治疗，组织因子阳性微粒低的将不予以低分子肝素治疗，所有组每2个月行下肢血管彩超检查，实验持续6个月，实验结果显示血管终末端是典型的血栓，或彩超下是无症状的静脉血栓，这个实验证明了组织因子阳性微粒与血栓有一定的关联，但此项研究截止目前结果还为公布。

3 结语

血栓性疾病一直是困扰患者及义务工作者的大难题，近几年，血栓性疾病患者的入院人数日趋上升。因此，对血栓性疾病的病因机制研究受到广泛关注，病因机制相当复杂，本我概述了最近几年组织因子阳性微粒对血栓疾病影响的研究进展。综上所述，他们之间存在一定的联系，但还不是很明确。是组织因子阳性微粒促使了血栓的形成，还是血栓性疾病加速组织因子阳性微粒高表达尚无依据，所以建立组织因子阳性微粒标准的检测路径及指标，进一步深入研究两者间的作用有这非常重要的临床意义。

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