不同部位诱发癫痫动物模型对比研究

杜 鹏，木依提，栾新平，贾宏宇，苑 杨，徐敬轩，张晶晶

不同部位诱发癫痫动物模型对比研究

杜 鹏，木依提，栾新平，贾宏宇，苑 杨，徐敬轩，张晶晶

目的 探讨铁离子不同部位诱发外伤性癫痫动物模型的稳定性和可靠性。方法 健康成年雄性大鼠50只，随机分为5组:SDA、SDB、SDC、SDD、SDE，各10只，其中SDA、SDB为对照组;SDC、SDD、SDE为癫痫模型组，采用不同方法制备癫痫模型，点燃成功后，收集行为表现、脑电图、组织病理等3方面资料，行统计学分析。结果 研究结果显示SDC、SDD、SDE均能点燃癫痫动物模型，其中SDD点燃动物模型出现早，持续时间短，不适合作为人类癫痫基础研究;组织病理方面，SDA和SDB比较P＞0.05，差异无统计学意义，排除实验干扰导致海马CA1神经元细胞丢失;SDC、SDD、SDE均能使CA1区锥体细胞数减少，与对照组相比P＜0.01，差异有统计学意义;对侧相比P＜0.01，差异有统计学意义;3组同侧之间比较P＞0.05，差异无统计学意义。结论 额叶皮层运动区注射铁离子操作简单、成功率高、可靠性好，相比于其他两种，更为适合外伤性癫痫基础研究和药物研究。

铁离子;外伤性癫痫;动物模型

外伤性脑损伤后红细胞外渗、溶解和含铁血黄素沉积于神经组织内，引起一系列的病理变化，导致癫痫发作，是外伤性癫痫(posttraumatic epilepsy，PTE)产生基础。目前外伤性癫痫(PTE)包括液压打击模型、自由落体模型、铁模型、皮层底切模型、控制性皮层撞击模型［1］。铁离子在癫痫形成中所起作用已得到了绝大多数临床医师的肯定。为此我们采取铁离子不同方法制备癫痫动物模型，以探讨铁离子诱导PTE实验动物模型的稳定性和可靠性。

1 资料与方法

1.1 实验动物及分组 健康成年雄性SD (Sprague Dawley)大鼠(由新疆医科大学实验动物中心提供)50只，体重180～220g，动物模型随机分为5组:正常对照组(SDA)、假手术对照组(SDB)、铁离子皮层注射致癫痫组(SDC)、铁离子导入组(SDD)、铁离子杏仁体注射组(SDE)各10只，共计50只动物。

1.2 癫痫模型制作 实验动物以10%水合氯醛(350m/g)腹腔麻醉，固定于立体定向架上，根据注射部位确定钻颅部位。钻开颅骨，根据包新民［2］等大鼠脑立体定位图谱，微量进样器缓慢进针至靶点(大鼠右额叶皮质坐标为:前囟前2.0mm、中线旁3.0mm、硬膜下2.0mm;杏仁核坐标为:前囟后2.8 mm、中线旁4.8mm、硬膜下8.0～8.5mm)。SDB组在右额叶皮质坐标区、杏仁核坐标区注人等量的生理盐水;SDC组为右额叶皮质内注射FeCl2(0.1mol/ L)10μl;SDD组方法为在右额叶皮层坐标区钻孔，星状切开硬脑膜。将尖端塞有棉花(防止细管内的FeCl3溶液溢出过快)的导入管尖端与软脑膜轻接触，细管内注有浓度为100mmol/L、pH值为1.5的FeCl3溶液。将一输出电流为100μA的电源的正、负极各连一针灸针。正极的针灸针插入细管内的FeCl3溶液中，负极的针灸针插入大鼠右前肢皮下，通电10min;SDE组方法为在杏仁核坐标区注入Fe－CI2(0.1mol/L)1μl。

1.3 行为学观察 按照Racinel经典的癫痫发作行为评分标准进行癫痫行为的观察和记录［3］:无任何癫痫发作行为记0分;凝视发作记1分;出现规律性点头或湿狗样抖动，伴有或不伴有面部抽动记2分;出现一侧前肢震颤记3分;站立、双前肢震颤及持续性点头记4分;双前肢震颤加重，失去平衡跌倒而出现全身性强直一阵挛性发作记5分;发作衰竭导致死亡记6分。各组大鼠给予视频录像监测，连续观测30d。

1.4 脑电图描记 于右额及右枕各钻一孔安装不锈钢电极，参考电极放置右耳，连接于POWERLAB生理记录仪。模型制备前、后60min分别记录动物的脑电变化。每组大鼠接受处理前后各描记脑电图1h，首先连续记录15min，然后每隔5min记录10min，1h内完成。脑电图资料用POWERLAB随机软件计算出痫样放电潜伏期、频率和波幅。根据Racine分级［3］，4级以上发作，脑电图在尖波或棘波的基础上出现阵发性或持续性异常放电为模型成功，以成功率表示。成功率的计算公式:(每组模型成功大鼠数/每组人选制模大鼠数)×100%。

1.5 组织学观察(HE染色、铁的染色及Nissl染色)FeCl2注射30d后腹腔麻醉，经左心室一升主动脉插管灌注生理盐水150ml、含4%多聚甲醛的0.1mol/PB(pH7.4，4℃)300ml取出大脑，常规脱水、透明、石蜡包埋。额叶(注射点层面)及海马层面连续冠状切片(厚3μm，每隔10片取2片)。行HE染色、铁的染色及Nissl染色。光镜(40×10倍)下双盲法连续计数2个视野双侧CA1区锥体细胞和齿状回(DG)细胞。

1.6 统计学方法 用SPSS16.0进行t检验，各组之间大鼠行为学评分、各组之间及两侧海马CA3区锥体细胞数两两比较用LSD检验，各组成功率两两比较用χ2检验，取α=0.05。

2 结果

2.1 行为表现差异 各组的Racinel癫痫发作行为评分比较显示:第一天，SDD组与其他各组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。其中，SDD组与SDA组、SDB组差异有统计学意义，说明SDD组可以诱发癫痫，与SDC组、SDE组比较，差异有统计学意义，说明SDD组诱发癫痫行为表现更为典型。SDC组、SDE组与SDA组比较，差异有统计学意义，说明均能点燃癫痫动物模型。第15天和第30天，SDD组与SDA组、SDB组、SDC组、SDE组差异有统计学意义，说明随时间推移，癫痫行为逐渐消失，说明维持时间不长，SDA组、SDB组与SDC组、SDE组比较显示SDC组、SDE组诱发癫痫行为随时间推移，行为表现越来越典型(见表1)。由此得出，SDD组不稳定，而SDC组、SDE组更趋向稳定。SDC组与SDE组在第1天、第15天、第30天对比，差异无统计学意义。

2.2 脑电图和病理结果差异比较 SDA组、SDB组脑电图表现为正常脑电图，而SDC组、SDD组与SDE组脑电图监测异常率分别为92%、95%、93%。说明，有行为学异常表现时脑电图上均有表现，结合行为学和脑电图更加证明癫痫模型诱发成功。SDA组与SDB组对比，差异无统计学意义(P＞0.05)，而SDC组、SDD组、SDE组两侧对比，以及同侧与SDA组、SDB组同侧对比显示CA1区锥体细胞数明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)(见表2)。

表1 各组动物模型1d、15d、30d Racinel癫痫发作行为评分比较

表2 各组两侧CA1区锥体细胞数变化

3 讨论

一个较理想的癫痫模型应具有和人类癫痫相似的发生、发展过程。至少应具备以下特征［4］:(1)具有诸如神经细胞丢失、胶质细胞增生、轴突丝状芽生和突触重建等与人类癫痫相似的病理学基础;(2)在初始刺激与自发性癫痫发作之间有较为固定的潜伏期(数天至数周);(3)模型在一定时间内保持大脑神经元兴奋性持续增高。本试验通过建立动物模型，从行为、脑电图、组织病理3方面探讨铁离子不同方法诱发的癫痫动物模型不同点。目的在于便于寻找一种最为接近人类的癫痫动物模型。

实验研究表明，结合行为和脑电图两方面发现铁离子皮层注射、铁离子导入蛛网膜下腔、铁离子杏仁体注射均能导致癫痫发生，均能点燃癫痫动物模型，铁离子导入蛛网膜下腔导致的动物模型产生的症状主要位于第一天，随后逐渐恢复正常。而人类癫痫存在初始刺激与自发性癫痫发作之间有较为固定的潜伏期(数天至数周)，故铁离子导入蛛网膜下腔动物模型与其他两种相比，不适合作为人类难治性癫痫的药物、发病机制研究。但早期诱发出强烈癫痫，成功率高(95%)模拟人类蛛网膜下腔出血所产生的癫痫，故有利于蛛网膜下腔出血所致癫痫的研究。运动皮层、杏仁体注射诱发癫痫动物模型，从行为表现方面、脑电图无差异，但杏仁体注射动物模型制备和额叶运动皮层比较，相对要困难，故额叶皮层注射铁离子更适合人类癫痫及难治性癫痫发病机制、药物治疗等基础研究。文献上，已应用杏仁体注射铁离子的方法建立PTE动物模型进行有关的基础研究，但临床上额叶皮层的损伤远比单纯杏仁体损伤常见。额叶皮层注射容易定位，易于推广，更符合临床上颅脑创伤的特点，是局灶性外伤性癫痫的较为理想的模型制作方法。

颞叶癫痫术中切除病灶和癫痫灶脑组织发现人类癫痫病理最常见的病理学改变为局部神经元细胞变性、丢失，尤其以CA1区锥体细胞丧失最为严重，以及胶质细胞增生甚至胶质化结节形成［5］。此实验研究最后将实验动物处死海马CA1区制备病理切片发现:SDA组与SDB组对比说明排除实验干扰导致海马CA1神经元细胞丢失，同时，SDC组、SDD组、SDE组两侧对比，以及同侧与SDA组、SDB组同侧对比说明铁离子皮层注射、铁离子导入蛛网膜下腔、铁离子杏仁体注射诱导癫痫后同侧CA1区锥体细胞减少，对侧不受影响。说明一侧有明确癫痫致痫灶，其病理异常不会影响到对侧。若将异常癫痫致痫灶切除可治愈癫痫，为颞叶癫痫手术效果佳提供了理论依据，这与文献报道相符［6，7］。

以往研究发现，外伤性脑损害(Traumatic brain damage，TBD)后红细胞外渗、溶解和含铁血黄素沉积于神经纤维网内，与癫痫发生有直接联系，是人类外伤后的显著特征。此外只要皮质组织内存在血液，就易引起癫痫的发生。动物实验也提示，铁具有致癫痫作用，这种致痫作用与其氧化还原特性有关。由此表明，以铁离子致癫痫动物模型将更接近脑出血临床过程［8～10］，这与此项研究相符。

4 结论

铁模型优点有:(1)接近人类脑外伤后出血的临床与病理改变;(2)成功率高，稳定可靠;(3)潜伏期短，便于观察和干预性研究。其中额叶皮层运动区注射铁离子相比于铁离子导入蛛网膜下腔、铁离子杏仁体注射更为适合癫痫基础研究和药物研究。

［1］孙振兴，张 凯.外伤后癫痫的基础研究［J］.国际脑神经病学神经外科学杂志，2009，36(5):416－419.

［2］包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱［M］.人民卫生出版社，1991.121－127.

［3］Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulationⅡ.Motor seizure［J］.Electroencephalogr Clin Neurophysiol，1972，32 (2):281－294.

［4］Ambrosio DA，Fairbanks JP，Fender JS，et al.Post traumatl epilepsy following fluid pereussion injury in the rat［J］.Brain，2004，127(2):1－11.

［5］张 冰，李云林，栾国明.颞叶癫痫致痫灶的病理学研究进展［J］.解剖与临床，2008，1(5):315－316.

［6］Yamamoto N，Kabuto H，Matsumoto S，et al.Pha－poeopheryl－L－asothate－2－0－phosphate diester，a hydroxyl radieal seavenger.Prevents the oeeurrence of ePilePtic foci in a rat model of post－traumatic epilepsy［J］.Patho Physiology，2002，8(3):205－214.

［7］Ueda Y，Nakajima A，Tokumaru J.Antioxidant ability and liPid peroxidation in the hiPPoeampus with epileptogenesis induced byFe3+injection into the amygdaloid body of rats［J］.Neurochemical Res，2003，28(12):1895－1900.

［8］Tomkins O，Shelef I，Kaizerman I，et al.Blood－brain barrier disruption in post－traumatic epilepsy［J］.J Neurology，Neurosurgery，and Psychiatry，2008，79(7):774－777.

［9］Nissinen J，Pitkanen A.Effect of antiepileptic drugs on spontaneous seizures in epileptic rats［J］.Epilepsy Res，2007，73(2):181－191.

［10］Griesemer D，Mautes AM.Closed head injury causes hyperexcitability in rat hippocampal CA1but not in CA3pyramidal cells［J］.Neurotrauma，2007，24(12):1823－1832.

Comparative Study of epileptic animal models induced by different site

DU Peng，MU Yi－ti，LUAN Xin－ping，et al.(Department of Neurosurgery，The Second Affiliated Hospital，Xinjiang Medical University，Urumqi830063，China)

ObjectiveTo explore the different position induced posttraumatic epilepsy animal model stability and reliability.Method50 healthy adult male rats were randomly divided into 5 groups:SDA，SDB，SDC，SDD，SDE，10，SDA，SDB as the control group，SDC，SDD，SDE as epileptic model group，were prepared by different methods after successful epilepsy model was lighted respectively.Behavior，electroencephalogram，and histopathological observation of three aspects，data collection，statistical analysis were performed.ResultsThe study indicates that the SDC，SDD，SDE kindled epilepsy animal model.SDD lighted animal model appeared early，short duration，was not suitable as a human epilepsy foundation research;The difference of tissue pathology，SDA and SDB comparison was not statistically significantP＞0.05，exclusion experiment interference resulting in hippocampal CA1neurons cell loss;SDC，SDD，SDE decreased the CA1pyramidal cell number，compared with the control groupP＜0.01，the differences was significant compared with the contralateral，P＜0.01，the comparison of the three groups of ipsilateral has no significance.ConclusionPrefrontal cortex motor area injection of iron ion has the advantages of simple operation，high success rate，good reliability，compared to the other two，is more suitable for traumatic epilepsy in basic research and drug research.

Iron ion;Traumatic epilepsy;Animal model

R742.1

A

1003－2754(2013)06－0542－03

2013－04－14;

2013－05－30

新疆医科大学创新基金(XJC201143)

(新疆医科大学第二附属医院神经外科，新疆 乌鲁木齐830063)

木依提，E－mail:13699994376@163.com