姜黄素增强奥沙利铂对结肠癌裸鼠皮下移植瘤的抑制和诱导凋亡作用

胡万乐，郑建录，刘长宝

姜黄素增强奥沙利铂对结肠癌裸鼠皮下移植瘤的抑制和诱导凋亡作用

胡万乐1，郑建录2，刘长宝1

目的：探讨姜黄素增强奥沙利铂对肠癌HT-29细胞裸鼠移植瘤的诱导凋亡作用及其机制。方法：建立耐药肠癌HT-29细胞的裸鼠皮下移植瘤模型，将荷瘤鼠随机分为Con组（生理盐水）、Oxa组（奥沙利铂7.5 mg/kg）、Cur组（姜黄素50 mg/kg）和Oxa+Cur组（联合用药，奥沙利铂7.5 mg/kg和姜黄素50 mg/kg）。腹腔注射给药，每3 d 1次，共8次。给药后测量肿瘤体积。免疫组织化学法检测肿瘤组织细胞增殖因子(Ki-67)、凋亡抑制因子(XIAP)和核转录因子(NF-κ B)的蛋白表达。RT-PCR检测NF-κB和XIAP mRNA的表达。结果：Oxa+Cur组肿瘤体积和质量明显小于其他各组。与Con组相比较，Oxa组、Cur组和Oxa+Cur组的Ki-67蛋白表达显著下降；与Oxa组和Cur组相比较，Oxa+Cur组的Ki-67蛋白表达显著下降。与Con组相比较，Oxa组、Cur组和Oxa+Cur组的NF-κB和XIAP蛋白和mRNA的表达显著下降；与Oxa组和Cur组相比较，Oxa+Cur组的NF-κB和XIAP蛋白和mRNA的表达显著下降。结论：姜黄素可以通过下调Ki-67和NF-κB及XIAP基因表达，增强奥沙利铂对肠癌HT-29细胞移植瘤的抑制细胞增殖和诱导凋亡作用。

姜黄素；奥沙利铂；结肠癌；NF-κB；XIAP

结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，其引起的死亡率在西方国家恶性肿瘤中排第三位[1]。英国和美国的统计显示，两国2004年有新发结直肠癌病例140 000例，并且19%的患者在确诊时肿瘤已经发生了转移，2010年美国有新增结直肠癌患者142 570例，其中由结直肠癌引起的死亡人数为51 370例[2]。Folfox方案（5-Fu，四氢叶酸，奥沙利铂）可用于不可切除的肝脏转移，但是大约40%的结直肠癌对Folfox方案有耐药性。结肠癌细胞对化疗药物的高度耐受是其缺乏有效治疗药物的根本原因。因此寻找一种高效低毒的新药以增强奥沙利铂的化疗敏感性显得尤其重要。

姜黄素是中药姜黄的主要成分，其药理作用广泛，能影响肿瘤发生发展的多个环节和步骤，抗肿瘤机制和作用机理也是多方面的，美国已将姜黄素列为第三代抗癌药物来研究[3]。姜黄素可以抑制肿瘤细胞增殖，阻止细胞周期进展并诱导细胞凋亡[4]。还有研究发现，姜黄素可以增强长春新碱对大肠癌裸鼠移植瘤的化疗作用[5]。虽然对于姜黄素抗肿瘤的作用及其机制已经有了大量的研究，但是对于姜黄素增强奥沙利铂的化疗作用的研究还少有报道，本研究旨在探讨姜黄素增强奥沙利铂对大肠癌细胞HT-29裸鼠皮下移植瘤的化疗作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 药物和试剂 姜黄素购于美国Sigma公司。奥沙利铂（oxaliplatin）购于法国礼来公司，溶于生理盐水。兔抗人XIAP、NF-κB抗体购于美国abcam公司。Trizol试剂购于Invitrogen公司，cDNA第一链合成试剂盒购于Fermentas公司。

1.2 细胞培养 人结肠癌细胞株HT-29购自美国组织培养库（ATCC）。细胞培养于37℃含5%CO2的培养箱中。配制细胞培养液：使用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基，待培养细胞贴壁生长至培养瓶的70%～80%时，使用胰蛋白酶(GIBCO,USA)消化传代。

1.3 动物 32只BALB/c nu/nu雄性裸小鼠，4～6周龄体质量18～20 g，购于中科院上海实验动物中心。饲养于SPF屏障系统的洁净层流架内，温度(25±1)℃，相对湿度40%～60%。实验用裸鼠所用的垫料、食物、水等均经过灭菌处理。

1.4 造模、分组和药物干预 将对数期生长的细胞用以蛋白酶进行消化处理后调整细胞浓度，用不含血清的1640培养基对细胞进行洗涤。离心后将细胞混匀于无血清的1640培养基中。将制备的细胞悬液注射于裸鼠背部靠近右后肢部位的皮下，每只注射约200 μL 5×106个细胞。待肿瘤体积达到大约100 mm3时，将裸鼠随机分成Con组（生理盐水）、Oxa组（奥沙利铂7.5 mg/kg）、Cur组（姜黄素50 mg/kg）和Oxa+Cur组（联合用药，奥沙利铂7.5 mg/kg和姜黄素50 mg/kg）。分组当天开始腹腔注射给药。末次用药1周后用10%水合氯醛采用腹腔注射法麻醉裸鼠。用游标卡尺测量肿瘤长径A和短径B，处死裸鼠前称量裸鼠体重并肿瘤长短经。肿瘤体积计算公式按照v=π/6×A2×B[6]。用药结束后1周，解剖肿瘤瘤体，称重。取部分组织置于4%多聚甲醛固定，石蜡切片后做免疫组化染色。其余保存于液氮中做。

1.5 RNA提取及RT-PCR 将实验所用器物用DEPC水进行灭酶处理，包括研磨组织用的研钵，吸取试剂的移液枪枪头等。整个操作过程应尽量在低温下进行，以免RNA降解。称取50～100 mg冻存标本置于液氮冷却的研钵中研磨，研磨完成后，向标本中加入1 mLTriol试剂继续研磨；将磨好的组织移入到1.5 mL的去酶EP管中，按说明书的步骤提取RNA行RT-PCR。

所用引物序列：NF-κB：上游5'-AGCACAGATA CCACCAAGACCC-3'，下游5'-CCCACGCTGCTCTTC TATAGGAAC-3'，扩 增 片 段 300 bp，XIAP：上 游5'-TCAAAAACCAAATTTCTCTCTCTT-3',下游：5'-AGATGACTTAGGAAAATTCTGAAGTT-3'，扩 增 片段：292 bp，内参GAPDH：上游：5'-AACGGATTTGGT CGTATTGGG-3'，下游：5'-TCGCTCCTGGAAGATG GTGAT-3'，扩增片段：216 bp。将产物进行凝胶成像。应用Gel-Pro3.2软件分析PCR电泳图像。

1.6 免疫组织化学染色 免疫组织化学检测XIAP、NF-κB和Ki-67。对各组标本的同一横截面进行连续切片，脱蜡，梯度酒精水化，0.3%H2O2封闭，微波修复，滴加山羊血清封闭液，室温孵育10 min；兔抗人XIAP抗体（稀释度1∶300），NF-κB抗体（稀释度1∶500），Ki-67抗体（1∶300）4 ℃孵育过夜，PBS洗涤后滴加HRP标记的二抗37℃30 min，DAB显色3～5 min，冲洗后苏木素复染，流水冲洗返蓝后脱水封片镜检。应用IPP(Image-Pro Plus 6.0,Media Cybernetics,Silver Spring,MD)软件分析免疫组化图片。

2 结果

2.1 各组肿瘤体积和裸鼠质量的变化 裸鼠随机分组当天各组的肿瘤平均体积为(123.3±7.6)mm3,各组裸鼠平均体重为（21.6±1.1）g，差异均无统计学意义。末次用药后1周,各组肿瘤体积见表1，图1。

表1 姜黄素增强奥沙利铂的抑瘤作用

图1 姜黄素增强奥沙利铂的抑瘤作用。末次用药1周后，各组肿瘤质量和体积。与Con组相比，aP＜0.05

2.2 姜黄素联合奥沙利铂对Ki-67蛋白表达的影响 各组中Ki-67表达量的变化（图2）：在×400光镜下随机选择10个视野，细胞增殖指数Ki-67阳性率计算公式参照：Ki-67阳性细胞数/细胞总数×100%。结果显示：与对照组相比，姜黄素组Ki-67表达量显著下降（P＜0.05）；联合治疗组与奥沙利铂组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。姜黄素联合奥沙利铂可以抑制细胞增殖因子Ki-67的表达（如表2、图2）。

2.3 姜黄素联合奥沙利铂对NF-κB和XIAP mRNA和蛋白的表达的影响 应用IPP软件对免疫组化图片进行分析，各组肿瘤组织中NF-κB和XIAP蛋白的表达量以累积光密度值的形式表示。与对照组和奥沙利铂组相比，姜黄素和联合组可显著下调NF-κB的表达量，差异有统计学意义（P＜0.05）（如表2、图2）。与对照组和奥沙利铂组相比，姜黄素和联合组可显著下调XIAP的表达量，差异有统计学意义（P＜0.05）（如表2、图2）。与对照组相比，姜黄素组NF-κB mRNA的表达量显著下降，联合组与奥沙利铂组相比NF-κB mRNA的表达量显著下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与对照组相比姜黄素组XIAP mRNA的表达量显著下降，联合组与奥沙利铂组相比XIAP mRNA的表达量显著下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）（如图3、4）。

表2 免疫组化法检测各组肿瘤组织中Ki-67、NF-κB和XIAP的表达

图2 免疫组化法检测各组裸鼠瘤体中Ki-67、XIAP和NF-κB的表达（×400）

图3 PCR法检测各组裸鼠瘤体中NF-κB和XIAP的表达

图4 各组肿瘤中NF-κB和XIAP mRNA的表达量的变化，与对照组相比，aP＜0.05

3 讨论

Ki-67是一种存在于增殖细胞中的核抗原，是增殖性细胞核的标记物，代表了细胞的增殖水平，是检测肿瘤细胞增殖活性的最可靠的指标之一[7]，本研究结果显示：与对照组相比，姜黄素组Ki-67表达量显著下降（P＜0.05）；联合治疗组与奥沙利铂组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。姜黄素联合奥沙利铂可以抑制细胞增殖因子Ki-67的表达。说明姜黄素可以抑制肿瘤细胞增殖。

程序化的细胞死亡—凋亡是细胞内在的死亡程序，它参与细胞的许多病理生理进程，在生物细胞中具有高度的保守性[9]。参与细胞凋亡的信号转导通路有两条，一是内源性的死亡受体通路，一个是外源性的线粒体通路。胱天蛋白酶家族—caspase蛋白参与这两条通路当中，在细胞凋亡中发挥重要作用[8-9]。XIAP（X染色体相关凋亡抑制蛋白）是一种凋亡抑制因子，它可以通过抑制Caspase家族蛋白的活性来发挥抗凋亡作用，事实表明，XIAP的过量表达是肿瘤细胞化疗效果不好的重要原因之一[10]。NF-κB作为一种核转录因子，在肿瘤细胞恶性转化和增殖过程中发挥重要作用，参与到肿瘤的发生、生长、转移和血管生成等环节[11]，传统化疗药物包括：长春碱、吉西他滨、顺铂、阿霉素等能激活细胞中的NF-κB[12-13]，激活的NF-κB转移到细胞核内，进而调控凋亡抑制蛋白IAPs（细胞凋亡抑制因子）包括XIAP因子[14]。有文献报道，NF-κB在大肠癌中呈持续激活状态，而抑制NF-κB能有效抑制大肠癌细胞生长[15]。本课题研究结果显示，在基因和蛋白水平，对照组和奥沙利铂组NF-κB均呈高表达，姜黄素可以抑制NF-κB mRNA和蛋白的表达，导致核转录因子NF-κB表达量下降。

姜黄(Curcuma longa)是姜科植物姜黄的根茎,主产于中国、印度、日本等国。姜黄主要成分姜黄素具有广泛的药理作用,而对于姜黄素抗肿瘤作用的研究,长期以来主要集中在肿瘤的化学预防方面。本实验裸鼠移植瘤动物模型研究显示，姜黄素和奥沙利铂联合组肿瘤抑制作用明显高于奥沙利铂单药组，表明姜黄素可以增强奥沙利铂对结肠癌的化疗效果。同时，联合用药组裸鼠体重下降不明显，与奥沙利铂组相比，差异有统计学意义。此现象提示，姜黄素在增强奥沙利铂对结肠癌裸鼠移植瘤化疗作用同时还可以降低毒副作用。

总之，姜黄素联合奥沙利铂可有效增强结肠癌的化疗敏感性，增强化疗效果。笔者初步认为其机制可能是通过抑制核转录因子NF-κB的表达，下调XIAP基因的表达，从而使肿瘤细胞对化疗药物的凋亡抑制作用降低，有效抑制肿瘤细胞的增殖，从而达到增强化疗效果的作用。

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Curcum Enhances Anti-tumor Effect of Oxaliplatin on Colorectal Cancer Cell Xenograft

HU Wan-le,ZHENG Jian-lu,LIU Chang-baoThe Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou(325027),China

ObjectiveTo investigate the enhanced effect of oxaliplatin by Curcum on HT-29 cell xenograft on athymic.MethodsThe models of HT-29 cell xenograft on athymic mouse were established and random⁃ized to four groups with intraperitoneal(IP)injection of different drugs(group Con 0.9%sodium chloride),group Oxa(oxaliplatin，7.5 mg/kg),group Cur(Curcum 50 mg/kg）and group Oxa+Cur(oxaliplatin 7.5 mg/kg and Cur⁃cum 50 mg/kg in combination).The drugs were injected once every 3 days,8 times in all.The mice were sacri⁃ficed 1 week after the last injection.The tumor volume and tumor weight were measured during the drug thera⁃py.Immunohistochemistry(IHC)was performed to detect the expression of NF-κB,XIAP and Ki-67,RT-PCR was performed to detect the expression of NF-κB and XIAPmRNA.ResultsOne week after the last adminis⁃tration,the mean tumor volume and tumor weight in group Oxa+Cur were significantly decreased as compared to the other groups.IHC analysis showed the expression of NF-κ B and XIAP were down regulated in Cur and Oxa+Cur groups as compared to the other two groups.The expression of Ki-67 was also down regulated signifi⁃cantly in Oxa+Cur group as compared to the other groups.RT-PCR analysis showed the expression of NF-κB and XIAP mRNA in Con and Oxa+Cur groups were down regulated significantly as compared to the other groups.ConclusionCurcum can enhance the anti-tumor effect of oxaliplatin on colorectal cancer xenograft.Downregulation of NF-κB and XIAP is possibly one of the mechanisms.

Curcum;Oxaliplatin;colorectal cancer;XIAP;NF-κ B

刘长宝，E-mail：liuchangbao2008@yahoo.com.cn

Q95-33；R735.3+5

A

1007-6948(2013)02-0149-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2013.02.016

1.温州医学院附属第二医院中西医结合肛肠科（温州 325027）

2.温州医学院第二临床学院研究生

（收稿：2013-01-02 修回：2013-02-26）

（责任编辑 张淑坤）