SOX2在结直肠癌组织中的表达与临床病理学意义

张 霆，刘 彤，刘 刚，赵 科

SOX2在结直肠癌组织中的表达与临床病理学意义

张 霆，刘 彤，刘 刚，赵 科

目的：探讨结直肠癌组织中SOX2的表达及与结直肠癌临床病理特征的关系,为指导结直肠癌的临床治疗及预后判断提供重要依据。方法：收集150例结直肠癌组织标本，采用LSAB免疫组化法检测癌组织中SOX2的表达。采用实时RT-PCR检测其中3例癌组织及癌旁组织中SOX2 mRNA的表达情况，分析SOX2蛋白表达与肿瘤临床病理的相关性。结果：SOX2阳性表达主要位于结直肠癌癌细胞的细胞核内，且在127例呈中高表达（表达率84.6%）显著高于例癌旁结直肠组织中的高表达（8%,P＜0.01）。SOX2 mRNA在结直肠癌组织的表达水平是癌旁结直肠组织的2.5～15倍。SOX2蛋白表达与结直肠癌患者的年龄、性别以及肿瘤部位、大小等无相关性(P＞0.05)，但与结直肠癌的浸润深度、淋巴结转移、Dukes’分期有显著相关性(P＜0.01)。结论：结直肠癌组织中SOX2蛋白和mRNA的表达显著高于癌旁结直肠组织，其表达与结直肠癌的浸润深度、分化程度、淋巴结转移、Dukes’分期有关。

SOX2；结直肠癌；基因表达；临床病理特征；相关性

SOX(sry-related high mobility group box contatining)基因家族最早由Gubbay等[1]，在Y染色体缺失的小鼠体内发现。该基因家族分布广泛，迄今为止，在鸟类、果蝇、爬行类、鱼类哺乳类以及人类等多种生物物种体内已发现有30余种该家族的基因或基因片段存在。在对胃癌、胰腺癌等肿瘤的研究中发现，SOX2的表达与肿瘤的侵袭转移密切相关[2]。结直肠癌是肠道系统中最为常见的恶性肿瘤，尽管临床上可对其采取手术、化疗等综合治疗措施，但其发病率和死亡率仍然居高不下，据统计，我国2005年结直肠癌发病率和死亡率分别为24.7/（10万）和14/（10万），且结直肠癌的发病呈逐年上升趋势[3-4]。肿瘤的侵袭和远处转移仍然是结直肠癌患者目前的主要死亡原因[5]。本研究通过检测SOX2在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达情况，探讨其与结直肠癌发生发展衍进的关系，以期望为结直肠癌的早期诊断、治疗和预后提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集我院2008年1月—2012年1月期间手术切除的结直肠癌组织标本150例，同时收集3例相邻癌旁结直肠黏膜标本。癌旁结直肠组织均取自距肿瘤原发灶2 cm的切除肠管。另外收集3例切除的结直肠癌及癌旁结直肠组织,进行Real time RT-PCR检测。所有标本资料完整，均经过我院病理组织学确诊。采用国际抗癌协会（UICC）2002年第6版TNM分期系统进行临床诊断分期。

1.2 主要试剂 SOX2抗体购自美国abcam公司，货号ab79351，鼠单抗。免疫组织化学试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。Real time RT-PCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，Sox2及β-actin的上下游引物序列均由上海英骏生物技术有限公司。

1.3 免疫组织化学染色 采用抗生物素蛋白链菌素生物素标记法（LSAB）进行免疫组织化学染色。免疫组化试剂盒说明操作进行。

1.4 Real time RT-PCR检测SOX2 mRNA表达 提取结直肠癌及癌旁结直肠黏膜组织RNA（按照TaKaRa试剂说明进行），用Trizol方法提取总RNA，测定样本A260/A280及样本浓度。逆转录合成cDNA，30 ℃、10 min，45 ℃、30 min，94 ℃、2 min，5 ℃、5 min。一部分行凝胶电泳，对SOX2 mRNA水平进行半定量检测。（另一部分用作定量PCR检测，定量PCR反应采用10 μL体系，按TaKaRa反转录试剂盒说明书进行操作。PCR引物序列β-actin：S：5'-TGGAATCCTG TGGCCATCCATGAAAC-3'AS：5'-TAAAACGCAGCT CAGTAACAGTCCG-3'，扩 增 片 段 长 度 为 360 bp；SOX2：S：5'-CCCACCTACAGCATGTCCTAC-3'， AS：5'-GGAGTGGGAGGAAGAGGTAAC-3'，扩增片段长度：122 bp。PCR反应条件为：首先95℃、3 min；变性，95 ℃、30 s；退火，59 ℃、30 s；延伸，72 ℃、30 s；共40个循环。

1.5 结果判断 根据表达部位的阳性染色强度和阳性表达的细胞数量综合进行评分。⑴依据细胞胞核染色强度进行判读：a.细胞核无染色，记0分；b.浅棕色为弱阳性，记1分；c.染成棕色且无背景染色者为中等阳性，记2分；d.染成棕褐色且无背景着色者为强阳性，记3分。⑵每张切片镜下（×200）随机选择10个高倍视野，以阳性细胞比例进行计分：a.无阳性染色，计0分；b.阳性细胞数≤25%，计1分；c.25%＜阳性细胞数＜50%，计2分；d.阳性表达细胞数≥50%，计3分。由两名病理学医生按照上述标准进行评分，再将两者评分结果相乘，结果小于等于2分者定为低表达，大于2分者定为高表达。

1.3 统计学分析 采用SPSS 17.0软件χ2检验进行统计学分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SOX2在结直肠癌及癌旁组织中的表达 免疫组化染色结果显示，SOX2阳性表达主要位于结直肠癌肿瘤细胞以及癌旁黏膜上皮细胞的细胞核内，在150例结直肠癌及癌旁组织中，127例结直肠癌呈阳性高表达，仅12例癌旁结直肠组织呈阳性高表达，癌组织中的阳性表达率（84.6%）显著高于例癌旁组织（8%）(图1)，见表1。

图1 SOX2在结直肠癌、癌旁结直肠黏膜组织中的表达情况

表1 SOX2在结直肠癌组织及癌旁结直肠组织中的表达情况

2.2 结直肠癌组织及癌旁组织中SOX2 mRNA的表达 实时定量PCR结果显示，结直肠癌组织SOX2 mRNA的表达量是癌组织的2.5～15倍（图2A）。半定量PCR结果显示，癌组织SOX2mRNA水平显著高于癌旁组织（图2B）。

图2 SOX2 mRNA在癌旁组织及结直肠癌组织中的表达

2.3 结直肠癌中SOX2的表达情况与临床病理参数之间的关系 统计分析显示，SOX2的表达与结直肠癌患者的年龄、性别以及肿瘤部位、大小、分化等无相关性（P＞0.05），但与结直肠癌的浸润深度、淋巴结转移、Dukes’分期等有显著相关性（P＜0.01），见表2。

表2 结直肠癌组织SOX2的表达与结直肠癌临床病理参数的关系

3 讨论

SOX2、OCT3/4、Nanog作为3个重要的干细胞核转录因子在干细胞干性维持、多向分化、细胞命运决定等方面发挥着重要且关键的作用。Matusuoka等[6]研究发现，上述三个分子在胃癌的侵袭转移过程中发挥了不同的协同作用，SOX2的表达位置主要位于胃癌细胞的侵袭前沿，它的阳性表达与胃癌的侵袭转移和淋巴管浸润密切相关，并且与患者的预后有显著的正相关性。SOX2的表达对胰腺癌细胞的侵袭转移也密切相关[7]。SOX2的表达与结直肠癌肿瘤的临床病理特征之间是否存在显著的相关性还未见报道。本研究结果表明，SOX2的表达与结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤发生部位、分化程度等临床病理特征间无显著相关性，而与肿瘤的浸润深度、Dukes′分期、淋巴结转移等临床病理特征密切相关。我们的研究发现，SOX2在结直肠癌组织中的表达（84.6%）显著高于癌旁结直肠组织（8%，P＜0.01）。Real time RT-PCR进一步证实了SOX2在结直肠癌组织中的表达也显著高于癌旁结直肠组织。

结直肠癌是人类常见的恶性肿瘤，其死亡率居恶性肿瘤死因第二位，这主要归因于进展期后的结直肠癌预后极差[8]。结直肠癌的发生、发展与环境、饮食结构、遗传突变、慢性炎症以及亚硝胺类致癌物等因素密切相关，是多种基因协同相互作用的结果。包括腺瘤性息肉病基因（APC）、结直肠癌突变基因（MMC）的突变，错配修复基因（MMR）的失活，p53基因的突变与缺失，K-ras基因的改变，以及结直肠癌缺失基因（DCC）的缺失等[9]。结直肠癌的防治研究不断引起人们的关注和重视，通过对相关基因的检测，对临床预测结肠癌的发生、发展、疗效及预后判断都有一定的指导意义。我们的研究表明，作为胚胎及成体干细胞中重要的核转录因子SOX2在结直肠癌中高表达（84.6%），在结直肠癌旁黏膜组织中低表达（8%），这表明SOX2基因的异常高表达可能在肿瘤的发生过程中发挥了癌基因的功能，在对150例临床手术标本免疫组织化学染色分析以及Real time RT-PCR等检测3例结直肠癌标本和癌旁结直肠黏膜组织的研究发现，SOX2在结直肠癌中的高表达与结直肠癌发生的年龄、性别、肿瘤部位、分化程度等无显著相关性，而与肿瘤的肿瘤的浸润深度、Dukes′分期、淋巴结转移等临床病理特征密切相关。淋巴结及远处转移是影响结直肠癌预后不良的重要因素之一，20%～40%结直肠癌患者临床确诊时已发生有肝转移，根治术后发生肝转移仍可达40%～50%，50%以上的死亡患者存在肝转移，而发生肝转移的病人往往都伴随有肠系膜淋巴结转移[10-12]。因此，研究结直肠癌转移的机制、抑制转移将显著提高结肠癌患者的生存率和生存质量。我们发现，SOX2异常高表达的结肠癌术后发生淋巴结转移明显高于阴性表达组，这提示SOX2基因异常高表达可能对结直肠癌术后淋巴结转移起到了一定的促进作用。

综上所述，我们的研究结果表明SOX2参与了结直肠癌的衍进、侵袭和转移，这可为为结直肠癌的生物靶向治疗提供新的靶点和思路。然而，其具体的机制还有待进一步的研究证实。

[1]Gubbay J,Collignon J,Koopman P,et al.A gene mapping to the sex determining region of the mouse Y chromosomeis a member of a novel family of embryonically expressed genes[J].Nature,1990,346(6281)：245-250.

[2]许森林，余时沧.SOX2参与恶性肿瘤生物学行为调控的研究进展[J].重庆医学，2012，41（15）：1543-1545.

[3]KIM J C，KIM S Y，ROH S A，et al． Gene expression profiling：canonical molecular changes and clinicopathological features in sporadic colorectal cancers[J].World J Gastroenterol，2008，14(43)：6662-6672．

[4]杨玲，李连弟，陈育德，等.中国2000年及2005年恶性肿瘤发病死亡的估计与预测[J].中国卫生统计,2005,22(4)：218-231.

[5]施凉潘，潘运龙．结直肠癌血管形成、侵袭和转移的研究进展[J].世界华人消化杂志，2008，16(1)：62-67.

[6]Matsuoka J,Yashiro M,Sakurai K,et al.Role of the stemness factors Sox2,Oct3/4,and Nanog in gastric carcinoma[J].J Surg Res,2010,Dec 18[Epub ahead of print].

[7]Sanada Y,Yoshida K,Ohara M,et al.Histopathologic evaluation of stepwise progression of pancreatic carcinoma with immunohisto⁃chemical analysis of gastric epithelial transcription factor Sox2：comparison of expression patterns between invasive components and cancerous or nonneoplastic intraductal components[J].Pancre⁃as,2006,32(2)：164-170.

[8]László L.Predictive and Prognostric Factors in the complex treat⁃ment of patients with colorectal cancer[J].Magy Onkol,2010,54(4)：383-394．

[9]Fearon ER，Vogelstein B1 A genetic model for colorectal tumouri⁃genesis[J].Cell，1990，61(5)：759-7671.

[10]丁印鲁，张建良，唐思锋，等.阻断趋化因子受体3途径对结肠癌患者术后局部复发和肝转移影响的研究[J].中华普通外科杂志，2008，23（1）：40-43.

[11]张建良，丁印鲁，胡三元.前哨淋巴结定位在结直肠癌外科治疗中的临床意义[J].中国现代普通外科进展,2006，9（3）：144-146.

[12]丁印鲁，傅勤烨，唐思锋，等.基质细胞衍生因子-1及其受体CX⁃CR4对结肠癌肝转移潜能的影响 [J].中华外科杂志，2009，（3）：210-213.

Expression and Clinical Pathological Significance of SOX2 in Colorectal Carcinoma

ZHANG Ting,LIU Tong,LIU Gang,et al.Department of General Surgery,General Hospital,Tianjin Medical University,Tianjin(300052),China

ObjectiveTo observe the expression of SOX2 in colorectal carcinoma and explore its clinico⁃pathological significance.MethodsSamples were collected from 150 patients with colorectal carcinoma.Im⁃munohistochemistry of LASB was used to detect the expression of SOX2,and real time RT-PCR was used to de⁃tect the expression of SOX2 in the remaining 3 samples to analyze the relationship of expression of SOX2 with colorectal carcinomas.ResultsThe SOX2 was found to be expressed in nuclear of colorectal carcinomas and carcinoma side mucosal epithelium.The expression of SOX2 was detected in a significantly greater pro⁃portion of cancer tissue(84.6%)than that of carcino⁃ma side tissue(8%).SOX2 mRNA levels in colorectal carcinoma tissue was 2.5 to 15 fold higher than that in carcinoma side tissue.By statistical analysis,the expression levels of SOX2 in colorectal carcinoma were not correlated with clinical pathological characteristics,such as age,gender and volume(P＞0.05).but correlated with the infiltration depth,metastasis,and Dukes’stages(P＜0.01).ConclusionThe expression of SOX2 is stronger in colorectal carcinoma than in carcinoma side tissue.The expression of SOX2 in colorectal carcinoma is correlated with some characteristics of clinical pathology.

SOX2;colorectal carcinoma;gene expression;Clinical and pathological characteristics;correla⁃tion

R735.34

A

1007-6948(2013)02-0136-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2013.02.012

天津医科大学总医院普通外科（天津 300052）

刘 彤，E-mail：billy8176@yahoo.com.cn

（收稿：2012-12-20 修回：2013-02-26）

（责任编辑 屈振亮）