茯砖茶中冠突散囊菌所产黄色系物质的研究

吕嘉枥, 韩 蓉, 沈 文, 王 珊

(陕西科技大学 生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

茯砖茶具有显著的促消化、降血脂、调节糖代谢和抑制肿瘤细胞等功效[1-3].冠突散囊菌是茯砖茶发花过程中自然形成的一种优势菌[4,5].关于茯砖茶中功能性物质报道较多，而关于冠突散囊菌的功能性物质有一些报道，但是对其所产的黄色系物质的结构方面研究还很少涉及.王波等[6]人从金花菌中提取获得了黄色素的提取液，并且推测该色素溶液中可能含有类胡萝卜素成分.因此，鉴于前人已对冠突散囊菌的生物学特性及生长条件做了大量的研究工作基础上，本课题采用麸皮固体培养基培养大量冠突散囊菌，对其所产黄色系物质进行提取分离纯化，并对其结构进行对比性探究，从而推测出可能的色素类型，为药品和保健食品的开发奠定基础.

1 材料与试剂

1.1 实验材料

1.1.1 冠突散囊菌

由陕西科技大学微生物研究室从陕西苍山茶叶有限责任公司所产茯砖茶中分离纯化得到.

1.1.2 培养基

麸皮和水以一定配比混合均匀，于121 ℃灭菌30 min.

1.2 试剂

石油醚(60～90沸程)，丙酮，乙酸乙酯，甲醇，冰乙酸，乙醚均为化学纯；β-胡萝卜素标准品，番茄红素标准品.

2 实验方法

2.1 保温提取单因素实验[7-9]

2.1.1 料液比单因素实验

取冠突散囊菌培养物5 g，分别按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g/mL)加入浸提液，50 ℃下保温提取1 h，过滤得提取液.测定并计算得率.确定最佳料液比.

2.1.2 提取时间单因素实验

取冠突散囊菌培养物5 g，按1∶30的比例加入浸提液，50 ℃下保温提取0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h，过滤得到提取液.测定并计算得率.确定最佳提取时间.

2.1.3 提取温度单因素实验

取冠突散囊菌培养物5 g，按1∶30的比例加入浸提液，分别在不同温度30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下，保温提取1 h，过滤得到提取液.测定并计算得率.确定最佳提取温度.

2.2 保温提取正交试验

据单因素实验结果，选择料液比、提取温度、提取时间3个因素，采用L9(34)正交表.

表1 试验因素水平

2.3 冠突散囊菌所产黄色系物质的纯化[10]

取黄色系物质粗品50.0 mg经石油醚溶解后与少量硅胶拌样，按湿法上柱进行柱层析分离，硅胶柱径高比1∶10，洗脱液为石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶冰乙酸=40∶10∶5∶1，收集目标色素组分，合并、浓缩和结晶，获得粉末状黄色系物质精制品；利用薄层层析，选取不同展开剂[11,12]，(1)展开剂I：石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶冰乙酸=40∶10∶5∶1.(2)展开剂II：石油醚∶丙酮=3∶1. (3)展开剂Ⅲ：石油醚∶丙酮=7∶3，将黄色系组分进行再分离；利用HPLC法，色谱条件为，色谱柱: Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm); 检测波长:λmax; 流速: 1 mL/min; 进样量: 20μL; 柱温: 室温; 流动相: 甲醇-乙腈-二氯甲烷(5∶80∶15)，对实验结果加以验证.

2.4 黄色系物质结构分析

2.4.1 黄色系物质TLC分析

将冠突散囊菌所产黄色系物质的石油醚提取液点于薄层板上，将点样后的薄层板放入展开缸中，比较两种标准品和样品的Rf值，确定是否为同类物质，点样顺序从左至右依次为：番茄红素标准品，β-胡萝卜素标准品，冠突散囊菌所产黄色系物质的石油醚提取液.

2.4.2 黄色系物质紫外扫描分析

取一定量的β-胡萝卜素，番茄红素标准液, 以石油醚为空白, 用紫外可见分光光度计对其在300～600 nm范围内进行扫描, 确定反应液的最大吸收波长.将纯化后的黄色系物质进行同波长段的紫外扫描，对照三者紫外扫描图谱.

2.4.3 黄色系物质红外图谱分析

将β-胡萝卜素，番茄红素标准品和黄色系物质进行红外光谱仪扫描，通过光谱图分析可能含有的官能团，进而推测可能的物质结构.

3 结果与讨论

3.1 保温提取单因素实验结果

3.1.1 料液比单因素实验结果

图1 料液比对黄色系物质得率的影响

由图1可知：当料液比从1∶10提高到1∶30，得率有明显的提高，之后加大料液比，得率也没有明显提高，所以选择1∶30为最适料液比.

3.1.2 提取时间单因素实验结果

图2 提取时间对黄色系物质得率的影响

由图2可知：当提取时间从0.5 h至1 h时，得率逐渐增大，随着时间的延长，得率呈少许下降趋势，但1.5 h之后又呈现上升趋势，由于得率上升程度不大，所以选1 h作为提取时间.

3.1.3 提取温度单因素实验结果

图3 提取温度对黄色系物质得率的影响

由图3可知：当温度从30 ℃升高到60 ℃时，得率明显增大，但继续升高温度，得率略有下降，可能温度升高使物质结构发生变化，从而对测定结果产生影响，因此，选60 ℃作为提取温度.

3.2 保温提取法正交试验结果

表2 正交试验结果

表3 方差分析

由表2，3可看出提取条件中各因素的主次为A(料液比)>B(提取温度)> C(提取时间),最优工艺为A3B2C2，即料液比1∶30，温度60 ℃，时间1 h.最高得率可达0.83%左右.

3.3 黄色系物质的纯化结果

利用保温提取法在料液比1∶30、温度60 ℃、时间1 h条件下，提取到粗品得率为0.83%；取粗品50.0 mg，利用柱层析分离，洗脱液为石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶冰乙酸=40∶10∶5∶1，获得精制品得率为60.8%.

图4 展开剂Ⅰ薄层图

图5 展开剂Ⅱ薄层图

图6 展开剂Ⅲ薄层图

图7 黄色系物质的HPLC图谱

由图4～7可知：黄色系物质的Rf值主要集中在0.6左右，展开剂Ⅰ只分离出一个黄色斑点；展开剂Ⅱ分离效果稍好，有三个明显的黄色斑点；展开剂Ⅲ将黄色系物质分离出4个斑点，且这四个斑点极性极为相似.由HPLC图谱可以看出，黄色系物质含有4个主要峰，进一步说明黄色系物质含有4种主要组分.有此可见：冠突散囊菌所产的黄色系物质不是单一组分，是包含了四种主要组分的混合物.

3.4 黄色系物质结构分析结果

3.4.1 薄层结果

图8 样品与标品对照薄层图

由图8可知：番茄红素，β-胡萝卜素标准品与黄色系物质的Rf值存在明显差异，由此可见，此黄色系物质和番茄红素，β-胡萝卜素可能不是同一类物质.

3.4.2 紫外扫描结果分析

图9 β-胡萝卜素紫外扫描图

图10 番茄红素紫外扫描图

图11 黄色系物质紫外扫描图

如图9～11所示：β-胡萝卜素的石油醚溶解液有两个较明显的最大吸收波长，分别是450 nm和478 nm；番茄红素的石油醚溶解液有三个较明显的最大吸收波长，分别是444 nm、470 nm和502 nm；黄色系物质的石油醚溶解液的最大吸收波长为394 nm，由此可见，冠突散囊菌所产的黄色系物质可能不是β-胡萝卜素或番茄红素.

3.4.3 红外结果分析

图12 番茄红素红外扫描图谱

由图12可知，在2 932 cm-1，1 381 cm-1处有特征吸收峰，可能含有-C-H，-CH3；在1 675 cm-1处有特征吸收，可能含有C=C；在1 452 cm-1处有特征吸收说明可能有芳香族化合物；在1 250～1 100 cm-1处没有特征吸收，说明没有C-O单键；在2 500～2 000 cm-1处没特征吸收峰，说明此物质中没有C≡C.

图13 β-胡萝卜素红外扫描图谱

由图13可知，在2 933 cm-1，2 875 cm-1，1 462 cm-1，1 379 cm-1处有特征吸收峰，可能含有-C-H，-CH3；在3 169 处有特征吸收峰，C=C-H；1 462 cm-1处有特征吸收说明可能有芳香族化合物；在1 250～1 100 cm-1处没有特征吸收，说明没有C-O单键；在2 500～2 000 cm-1处没有特征吸收峰，说明此物质中没有C≡C.

由图14可知，在2 927 cm-1处有特征吸收峰，可能含有-C-H；在1 587 cm-1，1 450 cm-1处有特征吸收说明可能有芳香族化合物；在1 160 cm-1处有特征吸收，说明可能含有C-O单键；在1 621 cm-1处有特征吸收，说明有C=C；在2 500～2 000 cm-1出没特征吸收峰，说明此物质中没有C≡C.因此，结合物质结构及红外图谱分析，冠突散囊菌黄色系物质中可能含有C-O单键，而两种标准品中不含有，所以可能不是一类物质.

图14 黄色系物质红外扫描图谱

4 结束语

保温提取法对茯砖茶冠突散囊菌所产黄色系物质得率影响的主次顺序为：料液比>提取温度>提取时间,即料液比1∶30，温度60 ℃，时间1 h.最高得率可达0.83%左右.通过TLC法，紫外光谱及红外光谱法，分析了β-胡萝卜素、番茄红素标准品和冠突散囊菌所产黄色系物质的极性、最大吸收波长、物质含有官能团等方面的差异，确定此黄色系物质不是β-胡萝卜素、番茄红素一类，且组分并不单一，是由四种结构类似物构成的混合物质.根据红外光谱图所显示的官能团，推测还有可能是叶黄素一类.关于黄色系物质结构的确定是十分复杂的问题，可进一步对其进行分离纯化，针对各个组分做质谱、核磁等方面的检测.具体结构鉴定仍需进行后续试验加以验证.

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