多孔陶瓷对粘细菌的吸附性能研究

龚国利， 刘丽丽， 王 娜， 游银伟

(1.陕西科技大学 生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021； 2.山东省农业科学院 高新技术研究中心， 山东 济南 250100)

0 引言

微生物固定化技术是利用化学或物理方法将细胞或微生物固定于材料的限定空间内[1].目前的固定方法主要有包埋法、吸附法、交联法，包埋法虽操作简单但不适用于微生物固定，其应用仍停留在试验阶段[2].多孔陶瓷吸附固定微生物技术已成为研究热点，尤其以无机材料为最.多孔陶瓷固定微生物主要借助于静电作用，对多孔陶瓷进行酸碱或金属盐处理，可使其裸露出或吸附正离子，对微生物的吸附力加强[3].埃博霉素因其具有抗真菌和细胞毒活性，已成为研究的热点[4,5].粘细菌作为埃博霉素的产生菌，如何提高其液体发酵产量是埃博霉素大规模生产的一大难题，若是以多孔陶瓷为载体对粘细菌进行吸附，可能会解决粘细菌液体发酵中聚团生长的难题[6]，提高埃博霉素产量.

本研究以粘细菌为试验菌株，硅藻土基多孔陶瓷为载体，对多孔陶瓷的吸附性能进行观察与试验研究，并对多孔陶瓷吸附粘细菌的吸附条件进行优化，为固定化粘细菌发酵制备埃博霉素提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 菌种

粘细菌SoF5-09，实验室筛选并保藏.

1.2 多孔陶瓷制备

将硅藻土、煅烧硅藻土、粘土、石蜡按质量比40∶35∶15∶2称量混合均匀，按粉料∶水=1∶10加入装有球磨介质的实验室球磨机(上海新诺QM1SP4行星式球磨机)300 r/min球磨30 min，80 ℃烘干打散后，加2% 40目木屑后混匀，喷洒5%蒸馏水制粒、陈腐后，压片(5 MPa)成型，尺寸为Ф10×2 mm，300 ℃干燥4 h，并于1 000 ℃下煅烧30 min，获得硅藻土基多孔陶瓷[7,8].制得多孔陶瓷的性能见表1.

表1 硅藻土基多孔陶瓷性能

1.3 多孔陶瓷处理

1.3.1 HCl处理多孔陶瓷

用0.2 mol/L HCl浸泡多孔陶瓷24 h后，倾去酸液用蒸馏水清洗，直至pH值接近中性.

1.3.2 FeCl3处理多孔陶瓷

以固液比1∶4的比例在多孔陶瓷中加入浓度为2 mol/L的FeCl3(pH=0.67)溶液，搅拌均匀后110 ℃烘干，每隔1 h搅拌一次，然后在马弗炉中500 ℃煅烧3 h，室温冷却后用蒸馏水冲洗至无色后110 ℃烘干待用[9].

1.4 菌悬液制备

配制30 mL M26培养基于200 mL锥形瓶中，30 ℃ 200 r/min恒温摇床培养3天；8 000 r/min条件下离心10 min，弃上清液，用30 mL蒸馏水重悬并打散菌体[10].同时采用干重法测定菌体浓度约为3.75 mg/mL.

1.5 吸附实验

用硅藻土基多孔陶瓷对粘细菌进行吸附，按陶瓷和菌悬液比5 g∶100 mL，于30 ℃，100 r/min摇床条件下进行吸附试验，每隔30 min取样，测定多孔陶瓷吸附量.每次试验重复3次，取其平均值以减少误差.

1.6 分析方法

1.6.1 吸附量测定

将已吸附菌的多孔陶瓷于60 ℃烘干至恒重m0，再经600 ℃灼烧30 min后称重m1，两者之差(m0-m1)为多孔陶瓷吸附量.

1.6.2 红外与电镜分析

用德国Bruker V70傅里叶变换红外光谱分析仪测定多孔陶瓷的FTIR图谱.

将已吸附菌的多孔陶瓷用2.5 %戊二醛浸泡固定12 h，蒸馏水清洗3次，经30 %、50 %、70 %、85 %、95 %、100 %乙醇梯度脱水与乙酸异戊酯置换两次后，进行冷冻干燥[11].用日立S-4800型扫描电子显微镜观察硅藻土基多孔陶瓷的微观形貌.

2 结果与讨论

2.1 多孔陶瓷吸附性能

2.1.1 不同处理方法对多孔陶瓷吸附量的影响

图1为多孔陶瓷、HCl处理的多孔陶瓷与FeCl3处理的多孔陶瓷随时间变化对粘细菌吸附量的变化曲线.从中看出，3种多孔陶瓷的吸附量均在3.5～4 h时达到饱和状态，且经FeCl3处理的多孔陶瓷对粘细菌的吸附量最高，主要是因为FeCl3处理多孔陶瓷的过程中，会转化成Fe2O3颗粒并粘附在多孔陶瓷表面，可中和陶瓷表面原有的负电荷，使其表面呈中性或带正电[9]，可有效地吸附带负电性的细菌.因此，本实验条件下，使用经FeCl3处理的多孔陶瓷进行粘细菌吸附试验较好.

2.1.2 FeCl3处理浓度选择

图2为不同浓度FeCl3处理的多孔陶瓷随时间变化对粘细菌吸附量的变化曲线.随着浓度增加，吸附量也随之增加，可能是因为粘附的Fe2O3越来越多的缘故；当FeCl3浓度为2.5 mol/L时，对粘细菌的吸附量与经2.0 mol/L FeCl3处理的多孔陶瓷的吸附量相差不大，可能是已达到吸附饱和的缘故.本实验条件下，选择2.0 mol/L FeCl3处理多孔陶瓷.

图1 不同处理多孔陶瓷对粘细菌吸附量变化

图2 不同浓度FeCl3处理多孔陶瓷对粘细菌吸附量变化

2.1.3 多孔陶瓷的FTIR谱分析

图3为硅藻土基多孔陶瓷与经FeCl3处理的多孔陶瓷的FTIR谱分析结果.图中480 cm-1附近处为Fe2O3的吸收峰，1 130 cm-1附近处为Si-O-Si的吸收峰[12]，且经FeCl3处理的多孔陶瓷在这两处的吸收峰明显加强，说明Fe2O3含量、Si-O-Si键增多；在1 600 cm-1、3 500 cm-1附近处为O-H的振动峰[13]，经FeCl3处理的多孔陶瓷在这两处的振动明显降低，可能是因为在处理过程中破坏了多孔陶瓷表面的结合水.这说明经FeCl3处理的多孔陶瓷在吸附粘细菌时有着更强的吸附作用.

图3 多孔陶瓷的FTIR图谱

2.1.4 多孔陶瓷的微观形貌

粘细菌细胞柔软，一般呈杆状，如图4(a)所示，本实验所培养的粘细菌长约3～5μm，宽约1μm，且粘细菌无鞭毛，可分泌粘液，采用滑动行为形成薄而扩展的菌落[14].这种粘液可能有利于多孔陶瓷对粘细菌的吸附固定.本实验室自制的硅藻土基多孔陶瓷孔径约5～10μm，经FeCl3处理的多孔陶瓷表面及孔径内覆盖有一层纳米级Fe3O2颗粒(图4(c)).在经过吸附试验后，可以看出陶瓷孔隙内有大量的粘细菌存在(图4(d))，说明所制的多孔陶瓷可以作为粘细菌的吸附载体.

图4 样品的SEM图

2.2 吸附条件的研究

2.2.1 温度对吸附量的影响

图4为FeCl3处理的多孔陶瓷在不同温度，100 r/min摇床条件下经吸附4 h后吸附量的变化.

由图可知，随着温度上升吸附量随之增加，在30 ℃时达到最高，即11.85 mg/g.这可能是因为粘细菌在30 ℃左右最为活跃，且温度的上升有利于粘细菌向多孔陶瓷表面及孔径内扩散.在35 ℃时吸附量急速下降，这可能是因为过高的温度使吸附的菌体不稳定，易脱落.因此在本实验条件下，吸附温度应在30 ℃.

2.2.2 转速对吸附量的影响

图5为FeCl3处理的多孔陶瓷在30 ℃不同转速条件下经吸附4 h后的吸附量变化.随着转速的增大，吸附量随之增加，因为转速的增加可加快粘细菌与多孔陶瓷的接触机会，但过高的转速也会增加多孔陶瓷间的摩擦碰撞，易使已吸附菌体掉落.因此在在本实验条件下，转速应在100 r/min.

图5 温度对吸附量的影响

图6 转速对吸附量的影响

2.2.3 吸附条件优化

本实验采用正交设计法，进一步探讨温度、转速、吸附时间对多孔陶瓷吸附粘细菌的影响.以吸附量为指标，选用L9(34)表安排实验，确定最优吸附工艺.吸附试验采用的因素与水平见表2，实验结果见表3.

表2 L9(34)因素水平表

由表3、4可知，温度、转速这两个因素对吸附量的影响较大，主次次序是转速、温度、吸附时间，最优方案是A2B2C1，即在30 ℃、100 r/min条件下吸附3.5 h吸附量效果最好.经验证后，吸附量达14.45 mg/g.

表3 正交试验结果

表4 方差分析结果

3 结论

将硅藻土基多孔陶瓷作为粘细菌的固定载体是可行的.研究表明，在经2.0 mol/L FeCl3处理的硅藻土基多孔陶瓷对粘细菌的吸附效果较好，吸附4 h后吸附量达10.6 mg/g；在对吸附试验的温度、转速、吸附时间进行优化后，当温度为30 ℃、转速为100 r/min、吸附时间为3.5 h时吸附量最大，达14.45 mg/g.为下一步多孔陶瓷固定粘细菌发酵制备埃博霉素提供实践基础.

[1] 杨柳燕,肖 琳.环境微生物技术[M].北京:科学出版社,2003.

[2] 程江峰,何国庆.蜂窝陶瓷固定化酵母细胞生物催化剂制备过程研究[J].食品科学,2003,24(5):91-94.

[3] 朱华清,廖润华,梁立强.多孔陶瓷的微生物固定化性能分析及探讨[J].中国陶瓷工业,2005,12(6):22-25.

[4] Diez J,Martinez J P,Mestres J,et al.Myxobacteria:natural pharmaceutical factories[J].Microb Cell Fact,2012,11:52-54.

[5] Roche H,Yelle L,Cognetti F,et al.Phase clinical trial of ixabepilone (BMS-247550),an epothilone B analog,as first-line therapy in patients with metastatic breast cancer previously treated with anthracycline chemotherapy[J].J Clin Oncol,2007,25(23):3 415-3 420.

[6] 曹文瑞.纤维堆囊菌GSUV-205发酵生产埃博霉素过程中关键因子的探索及优化[D].济南:山东大学,2011.

[7] 高如琴,郑水林,刘 月,等.硅藻土基多孔陶瓷的制备及其对孔雀石绿的吸附和降解[J].硅酸盐学报,2008,36(1):21-29.

[8] 巫红平,吴任平.硅藻土基多孔陶瓷的制备及研究[J].硅酸盐通报,2009,28(4):641-645.

[9] 赵玉华,贾 莹,张 旭.改性滤料去除有机物静态吸附试验研究[J].沈阳建筑大学学报(自然科学版),2007,23(5):814-817.

[10] 龚国利.粘细菌的Genome shuffling育种技术及其埃博霉素的高产菌株改良[D].济南:山东大学,2007.

[11] 钱乐天,周逸卿,邹珍友,等．微生物扫描电镜样品清洗方法的改进与固定干燥方法的比较[J].安徽农业科学,2009,37(23):86-88.

[12] 蔡元峰,薛纪越.安徽官山两种缕石粘土的成分与红外吸收光谱[J].矿物学报,2001,21(3):23-29.

[13] 闻 辂.矿物红外光谱学[M].1版.重庆:重庆大学出版社,1989:89-104.

[14] 刘 敏.粘细菌纤维堆囊菌的多细胞行为及纤维素酶分析[D].济南:山东大学,2002.