饲料中芽孢杆菌的检测及存在问题的分析

刘洪斌 侯东军 杨红菊 田晓玲 马 帅 姜艳彬 王 海 于 雷*

（1.农业部畜禽产品质量监督检验测试中心，北京 100125；

2.辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心，沈阳 110016）

饲料中芽孢杆菌的检测及存在问题的分析

刘洪斌1侯东军1杨红菊1田晓玲2马 帅2姜艳彬1王 海1于 雷1*

（1.农业部畜禽产品质量监督检验测试中心，北京 100125；

2.辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心，沈阳 110016）

本研究通过对饲料样品中的芽孢杆菌检测，发现目前国家标准GB/T 26428-2010《饲料微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测》中存在的一些问题：即通过国标方法鉴定，该饲料中的添加剂为枯草芽孢杆菌，而通过常规菌种鉴定的16S rDNA序列测定和生理生化指标分析，无法判定该结果。经过分子生物学方法，鉴定该细菌为解淀粉芽孢杆菌。作为暂时未经许可应用于饲料添加剂的解淀粉芽孢杆菌，以目前的国标方法还无法检出，本研究为探索其检测方法提供了一些建议。

饲料 微生物添加剂 芽孢杆菌 检测方法

微生物饲料添加剂又称益生素，是当摄入量足够时能对机体产生有益作用的活性微生物（FAO，WHO，2001），微生物饲料添加剂具有维护动物肠道健康、缓解不良应激、改善畜舍环境、调节机体脂肪代谢和改善畜产品品质的功能。还有研究者认为，微生物饲料添加剂具有替代抗生素功能的作用（徐鹏等，2012）。

在国外，早在20世纪60年代开始使用益生菌作为人类保健食品和饲料微生物添加剂，20世纪70年代美国、欧洲就有饲料微生物添加剂上市（何月英等，2005）。1989年美国食品药物管理局（FDA）和美国饲料公定协会（AAFCO）公布了44种“可直接饲喂且通常认为是安全的微生物” 作为微生态制剂的出发菌株。1999年6月，我国农业部第105号文件发布的《允许使用的饲料添加剂品种目录》，共计12种微生物，其中芽孢杆菌属包括枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌；2003年农业部第318号公告中规定了14种允许使用的微生物，地衣芽孢杆菌列入，但纳豆芽孢杆菌未列入；2006年农业部658号公告规定了16种允许使用的微生物，芽孢杆菌属包括枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌；2008年12月我国农业部1126号公告规定了16种允许使用的微生物，芽孢杆菌属依旧仅有枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。

本研究通过对饲料样品芽孢杆菌的检测，发现目前的国家标准GB/T 26428- 2010《饲料微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测》中存在的一些问题，其不能有效的区分枯草芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌，并提出了相应的改进方案。

1 材料与方法

1.1 实验材料

细菌染色体DNA提取试剂盒、2×Taq PCR Mastermix、DL2000核酸分子量Marker、100bp DNA Ladder购自天根生化科技（北京）有限公司；营养琼脂、LB培养基等购自北京陆桥技术有限责任公司；PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成；DNA测序由北京华大基因研究中心完成；API 50CHB细菌鉴定系统购自生物梅里埃中国有限公司。有机试剂均为国产分析纯。

1.2 饲料样品芽孢杆菌的检测

主要依照GB/T 26428-2010《饲料微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测》进行饲料中枯草芽孢杆菌的检测，并进行了少量的修改：菌落计数中，将芽孢杆菌的培养时间由48±2 hr缩短至18-20hr。

1.3 16S rDNA的克隆及序列测定

挑取3株通过GB/T 26428-2010方法分离得到的平皿单菌落，在LB培养基中37℃培养过夜，各取5mL 菌液提取染色体DNA，电泳定量后，用引物AD007 和AD008 进行PCR扩增，扩增体系50μL：上游引物2μL（10mM），下游引物2μL（10mM），模版1μL（约50ng），2×Taq PCR Mastermix 25μL，超纯水20μL。扩增条件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72℃，90 s；重复2～4 步骤，进行29 个循环；72℃，10 min。将扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳鉴定，以引物AD007 和AD008 进行测序，在NCBI 数据库中比对。

1.4 生理生化测定

将测序的3株细菌进行生理生化测试，分别取平皿单菌落，悬浮于10 mL 的API 50CHB培养基中，加入API 50CHB测试板中，37℃培养48 h后观察，与判读表比对获取生理生化信息。

1.5 枯草芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌的分子生物学鉴定

根据两篇文献（刘勇等，2010；曹凤明等，2008）报道的方法进行分子生物学鉴定并进行了小量修改，引物序列见表1。扩增体系50μL：上游引物2μL（10mM），下游引物2 μL（10 mM），模版1 μL（约50 ng），2×Taq PCR Mastermix 25μL，超纯水20μL。扩增条件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，60 s；重复2-4 步骤，进行29 个循环；72℃，10 min。将扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳鉴定，以相应引物进行测序，在NCBI 数据库中比对。

表1 试验选择的引物对

2 结果与分析

2.1 饲料样品的芽孢杆菌检测（国标方法）

将饲料样品梯度稀释后，涂布于营养琼脂平板中，37℃培养18hr后计数。在稀释倍数为106的3个平板中，其菌落数分别为39、41和49个。

取5个菌落进行确证实验，5株菌表面粗糙、不透明，灰白色；革兰氏染色阳性，镜检细胞为杆状，有芽孢，符合枯草芽孢杆菌的形态学要求。

按照GB/T 26428-2010进行了5株菌的7%氯化钠生长、V-P实验、硝酸盐还原实验、丙酸盐利用实验和D-甘露醇产酸实验。5株菌的生理生化指标相同，其结果如表2所示。

表2 饲料样品中芽孢杆菌生理生化指标（国标方法）

根据菌落形态、染色镜检及生理生化指标，通过GB/T 26428-2010判断该饲料样品中的含有芽孢杆菌，其含量为为4.3×107cfu/g。

2.2 16S rDNA序列测定

挑取3株通过GB/T 26428-2010分离得到的平皿单菌落，以引物AD007、AD008进行菌落PCR扩增，在1%的琼脂糖凝胶中电泳鉴定，其扩增产物均为1600bp条带（图略）。

取扩增产物，以AD007、AD008为测序引物，进行核酸序列测定。测序结果经NCBI数据库比对，3个菌落PCR获得的序列相同，其16S rDNA的序列与解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌中的多株菌同源性达到98%（如图1所示），可以判断其为芽孢杆菌属。

图1 芽孢杆菌的16S rDNA序列比对结果

2.3 生理生化测定

根据16S rDNA测序结果，选用适合于芽孢杆菌的API 50 CHB试剂盒进行各项生理生化指标的测定，在37℃温箱中培养48 h后，3株菌的生理生化指标相同，与判读表比对获得生理生化指标如表3所示。

经软件分析，该细菌为枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌，可信度为99%，但无法确定该细菌为枯草芽孢杆菌。

2.4 枯草芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌的分子生物学鉴定

根据16S rDNA序列测定及API 50CHB的生理生化指标，为了进一步判断该细菌，参考了文献中报道的两种分子生物学方法进行鉴定。

通过解淀粉芽孢杆菌的2对引物对扩增，在2%琼脂糖凝胶电泳中分别获得了736 bp和1 275 bp的条带，与文献中报道的结果相同，而通过枯草芽孢杆菌的2对引物对均为获得任何扩增条带（图略）。

将扩增出的条带测序，通过NCBI数据库比对，结果表明，两组测序结果均与解淀粉芽孢杆菌有很高的同源性，而与枯草芽孢杆菌的同源性很低，如图2和图3所示。

表3 芽孢杆菌的API 50CHB生理生化指标

图2 芽孢杆菌特异性基因序列比对结果1

图3 芽孢杆菌特异性基因序列比对结果2

3 讨论

3.1 现存国标存在的问题

目前应用于饲料中枯草芽孢杆菌检测的最新国标为GB/T 26428- 2010《饲料微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测》，其在检测时存在以下两点问题：

（1）芽孢杆菌生长迅速，最佳培养条件下每20 min即繁殖1代。在使用国标进行检测时，37℃培养48 h，菌落直径可以达到1 cm以上，按照标准中要求每个平板30～300个菌落，普通的90 cm平皿几乎铺满，很难进行计数。如果改为培养时间为18 h，则菌落较小，适于计数操作。

（2）在目前的国标中，暂无法对枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌进行区分，而后者暂时没有列在允许使用的饲料添加剂名单中。

3.2 枯草芽孢杆菌的鉴定

枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）、地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）、短小芽孢杆菌（B.pumilus）、萎缩芽孢杆菌（B.atrophaeus）是在进化上亲缘关系较为接近的芽孢杆菌（Robert MS，1994），这些菌从形态学到生理生化特征存在很多相同之处，在鉴定或检测中很难准确区分（东秀珠等，2001）。

芽孢杆菌最常用的鉴别方法为生理生化法，通过梅里埃的API 50CHB或Biolog的GEN III鉴定板均可以快速、准确的获得一系列指标进行鉴定，但其在有些芽孢杆菌区分鉴定中还存在一些局限性，例如枯草芽孢杆菌/解淀粉芽孢杆菌的鉴定、苏云金芽孢杆菌/蜡样芽孢杆菌/蕈状芽孢杆菌的鉴定。对于这些无法通过生理生化指标鉴定的菌种，通过分子生物学进行辅助鉴定，将能够更准确的进行芽孢杆菌的鉴定。

3.3 工业微生物菌种鉴定存在的问题

除了芽孢杆菌外，还有很多用于工业生产、畜牧养殖、环境保护等方面的细菌，由于这些菌种经过了选育，在某一方面具有特殊的形状，造成了其可能在生理生化指标方面与天然菌株存在一定的差异。

本研究中的解淀粉芽孢杆菌，可以在10%的NaCl培养基中生长；在生产厂家给出的鉴定报告中，对照菌株解淀粉芽孢杆菌KCCM不能再10%的NaCl培养基中生长，因此判定本研究中的细菌为枯草芽孢杆菌，结论有些武断。

通过全基因组测序，进行序列比对是最准确的菌种鉴定方法，但对成本和时间的要求都很高。但对于使用价值较高，已经有相同模式菌全基因组序列的工业生产菌来说，还是事半功倍的，其在避免生理生化指标产生误区时，也排除了普通分子生物学检测中菌体携带质粒造成的误判。

[1] 曹凤明，沈德龙，李俊，等.应用多重PCR鉴定微生物肥料常用芽孢杆菌[J].微生物学学报，2008，48（5）：651-656.

[2] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[3] 何月英，宁玲忠，曾德年，等.饲料微生物添加剂的研究[J].湖南畜牧兽医，2005（3）：3-5.

[4] 刘勇，李辉，李金霞，等.特异PCR方法对枯草芽孢杆菌群的鉴定区分[J].饲料工业，2010，31（4）：52-54.

[5] 徐鹏，董晓芳，佟建明.微生物饲料添加剂的主要功能及其研究进展[J].动物营养学报，2012，24（8）：1397-1403.

[6] FAO，WHO.Report of a joint FAO /WHO expert consultation on evaluation of health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria[M].Cordoba：Argentina，2001.

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