白花树组织培养技术研究

张亮亮，柳新红，林新春，李因刚，石从广，刘伊里，何云核*

（1. 浙江农林大学，浙江 临安 311300；2. 浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023；3. 浙江省青田县林业局，浙江 青田 323900）

白花树组织培养技术研究

张亮亮1,2，柳新红2，林新春1，李因刚2，石从广2，刘伊里3，何云核1*

（1. 浙江农林大学，浙江 临安 311300；2. 浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023；3. 浙江省青田县林业局，浙江 青田 323900）

以白花树种子为材料，对其进行试管繁殖研究。结果表明：将种子切除胚乳，只保留胚接种于培养基，可比未切除胚乳的提前长出子叶，并能降低污染率，提高成活率，污染率和成活率分别为11 %和82 %；以MS＋0.3 mg/L BA为增殖培养基，增殖效果最佳，增殖系数达到5.7，芽长为4.46 cm，芽多且粗壮；采用两阶段诱导白花树生根，以100 mg/L IBA处理3 d为最佳，生根率达到60%。

白花树；组织培养；快速繁殖

白花树（Styrax tonkinensis）又名越南安息香，俗称东京野茉莉，属安息香科安息香属落叶乔木，主要分布于热带亚热带地区海拔100 ~ 2 000 m的山坡、疏林中或林缘，在我国天然分布于云南、贵州、广西、广东、福建、湖南、江西和浙江等省区[1~2]，其中，浙江为其分布的新记录种[2]。该树种能耐贫瘠和干旱，具很强的萌芽更新能力[3]；早期速生，在浙江云和、遂昌和龙泉人工林优选试验中，4年生白花树的胸径、树高和材积等性状均显著高于本地对照的乡土树种[4]；木材为散孔材，树干通直，结构致密，材质松软，可作火柴杆、家具及板材[1]；种子油称“白花油”，可供药用，也可制备生物柴油性能，是一种比较理想的0#柴油替代品[5]；树脂称“安息香”，含较多香脂酸，是医药上贵重药材，并可制造高级香料[1]；花洁白下垂，清香美丽，是优良的园林观赏树种[6]；白花树树种优良，集油用、材用、药用和观赏于一身，目前有关其种子繁殖技术的报道也较多[7~11]，但缺少对其快繁技术的研究。本研究旨在对白花树的组织培养技术进行研究，为这一优良树种的种质资源保护和开发利用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

白花树种子为浙江省林业科学研究院苗圃当年采集，种源地江西吉水。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌培养体系的建立

1.2.1.1 材料处理 剥去种子的外壳，将种仁放于烧杯中，盖上纱布，用自来水冲洗 12 h。倒出自来水后，置于超净工作台内，以5.0 g/L次氯酸钠溶液（每50 mL加1滴吐温-20）真空抽滤消毒15 min，再用无菌水冲洗5次，最后将材料分为2组，A组为未切除胚乳，保留整个种仁，B组为切除胚乳，只留下胚，分别接种于诱导培养基上，每组处理100管，接种后，放于培养室暗柜，2 d后拿出。

1.2.1.2 培养条件 置于温度（25±2）℃、每天光照/黑暗为16/8 h、光强为2 500 ~ 2 800 lx的培养室中。

1.2.1.3 诱导培养基 MS＋30 g/L蔗糖＋2.5 g/L固化剂（Gelrite），灭菌前调pH值5.7，诱导种子萌发。培养6周后调查并统计外植体的污染率和成活率。

1.2.2 不同质量浓度BA和NAA组合增殖试验 以MS培养基为基础培养基，加入BA、NAA两种生长激素。研究BA（0、0.3、1、3 mg/L）与NAA（0、0.3、1、3 mg/L）不同组合对芽增殖和植株生长的影响[13]。选取1 ~ 2 cm的芽作为外植体，接种到上述培养基中。培养6周后观察和统计外植体增殖状况。

1.2.3 两阶段生根试验 第一阶段分别用100、300 mg/L的IBA处理不同天数（0、3、7、10、14 d）；第二阶段转入1/2 MS培养基[14]。选取1 ~ 2 cm的芽作为外植体，接种到上述培养基中。每种处理10管，培养6周后调查和统计外植体生根状况。

1.3 数据统计分析

数据初步统计分析均采用Microsoft Excel 2003处理，方差分析和多重比较分析采用SPSS 13.0处理。

褐化程度中0表示无褐化，1表示轻微褐化，2表示中度褐化，3表示深度褐化，4表示褐化死亡。

2 结果与分析

2.1 无菌培养体系的建立

白花树种子的千粒重为 184 g，外有一层硬壳，难剥去。种子含有胚乳，不易切除，给实验带来了巨大的障碍，需要在操作时极为小心，不能伤到胚。结果表明：接种切除胚乳的胚，可将污染率控制在11%左右，成活率较高，达到82%，且生长较快，7 d后就长出两片子叶；而接种没有切除胚乳的胚，在试管培育中，子叶从胚乳长出的阶段要多花约2周的时间，21 d后才长出子叶，有明显的差异（表1）。说明切除胚乳可以降低外植体的污染率，提高成活率，缩短生长周期，利于获得无菌材料。

2.2 不同生长激素对芽增殖的影响

采用BA 4个质量浓度（0、0.3、1、3 mg/L）与NAA 4个质量浓度（0、0.3、1、3 mg/L），共16个组合的处理，如表2。由表2可知，当BA的质量浓度一定，随着NAA质量浓度的增大，增殖系数呈递减趋势，芽长也逐渐变短，当培养基为MS＋BA 0.3mg/L＋NAA 0 mg/L时，增殖系数为5.7，芽长为4.46 cm，为16组数据中最大，说明在一定BA的浓度下，添加NAA不利于芽的生长，浓度越大，植株变的越矮，愈伤组织增多，褐化现象严重；当NAA的质量浓度一定，随着BA的增加，增殖系数先增大后减小，芽长先增加后减少，当培养基为MS＋BA 0.3mg/L＋NAA 0 mg/L时，增殖系数和芽长达到最大，说明添加适量的BA，有助于芽的增殖和生长。因此，白花树的最佳增殖培养基为MS＋BA 0.3mg/L，不添加NAA。

2.3 生根培养

IBA处理对生根诱导的影响见表 3。对白花树的生根诱导是木本植物试管快繁成功的关键。本试验采取两阶段、两不同浓度发根诱导白花树试管苗生根，6周后统计结果。结果表明，当IBA为100 mg/L处理时，生根率随IBA处理时间加长，呈现先升高后下降的趋势，处理3 d时，生根率最高，达到60%，平均根长达到5.8 cm，根初为乳白色，后为黄绿色，根系发达；当IBA为300 mg/L处理时，只有处理3 d的有发根，其余都没有发根，愈伤组织偏多，且褐化程度大。因此，IBA浓度太高，处理的天数太长，都不利于白花树根的分化。

3 结论与讨论

白花树是优良的油用、材用、药用和观赏树种，具有很大的开发前景，目前有关其种子繁殖技术的报道也较多；本实验通过研究其组织培养的技术，丰富了白花树的繁殖方法，为其以后的快速繁殖，良种选育和缩短育种周期提供了技术指导。

木本植物的组培快繁技术较难，目前能通过组培快繁的树木种类只占很少的一部分，安息香科中只有秤锤树（Sinojackia xylocarpa）有过组培的报道[15]。木本植物组培外植体的选用十分重要，本实验选用胚作为外植体，接种于MS培养基中。在实验中通过对比接种切除胚乳和不切除胚乳的胚，结果显示，切除胚乳的，不仅可以减少污染率，而且7 d后就可以长出子叶，含胚乳的却要21 d，明显缩短了胚的萌发时间。说明胚外层的胚乳延缓了胚的生长，而且在接种时增加了污染的概率，应将胚乳切除。

木本植物组织培养中外植体的增殖不仅与植物生长激素的种类由关，而且还与它的组合及浓度有关，本实验研究了BA与NAA不同浓度组合对芽增殖的影响。外植体随着BA浓度的增加，增殖系数和芽长先增加后减少，随着NAA浓度的增加，呈递减趋势。说明NAA的添加不利于芽的增殖，而一定浓度的BA，可促进芽的分化和增殖，并且在MS＋BA 0.3 mg/L时，增殖系数和芽长都达到最大。

生长素对组培外植体不定根的诱导有显著的作用。比较不同的生长素作用效果差异发现，IBA促进生根的效果较好[16]。但在生根预实验中发现，采用培养基 1/2MS＋IBA（0、1、3、10 mg/L）处理，植株不生根，褐化现象严重。采用两阶段诱导生根法，可以得到一定的缓解，用IBA处理不同天数，然后转入 1/2MS培养基中继续培养。生根诱导过程中，第1阶段的时间控制十分关键，时间过短不能起到刺激生根的作用，时间过长则植物愈伤组织增多，且容易褐化和枯梢；IBA浓度的控制也很重要，浓度过高则不利于植株的生根。IBA处理3 d，且浓度为100 mg/L，最适合白花树的生根，6周后，平均根长达5.8 cm，根系发达，但生根率只有60%。因此，对白花树生根培养的筛选还有待进一步研究。

[1] 中国树木志编委会. 中国树木志·第二卷[M]. 北京：中国林业出版社，1994.

[2] 柳新红，雷祖培，陈征海，等. 浙江安息香属一新记录种：越南安息香[J]. 浙江农林大学学报，2012，29（2）：319－320.

[3] 吴克选,曾志光,周小平，等. 东京野茉莉野外调查报告[J]. 江西林业科技，2002（2）：25－27.

[4] 李因刚，周小平，柳新红，等. 白花树人工林生长与优树选择的初步研究[J]. 浙江林业科技，2010，30（3）：24-28.

[5] 胡文杰，司志国，曹裕松，等. 东京野茉莉油制备生物柴油的工艺条件研究[J]. 江苏农业科学，2011，39（2）：380－382.

[6] 彭重华，张程，巫涛，等. 湖南安息香科种质资源及其在园林中的应用前景[J]. 广东农业科学，2011（7）：76－79.

[7] 范兰礼. 东京野茉莉育苗和造林试验[J]. 江西林业科技，2001（4）：3－4.

[8] 孟中贵，周正. 安息香的引种栽培技术[J]. 中药材，1992，15（4）：7－9.

[9] 戴晓龙. 东京野茉莉及繁育技术[J]. 特种经济动植物，2002（6）：21.

[10] 谢建秋，柳新红，王军峰，等. 东京野茉莉引种试验初报[J]. 浙江林业科技，2006，26（4）：33－35.

[11] 刘志强，肖水清，邹元熹，等. 3种阔叶树育苗技术及苗木生长规律研究初报[J]. 江西林业科技，2010，（3）：14－15.

[12] Murshige T, Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures[J]. Physiol Plant, 1962，15（3）：473－497.

[13] 陈懿涵，桂仁意，林新春，等. 花秆绿竹试管快速繁殖[J]. 浙江林学院学报，2008，25（3）：397－400.

[14] 曾余力，王旭峰，林新春，等. 白纹阴阳竹试管快繁技术研究[J]. 西南林学院学报，2010，30（3）：38－41.

[15] 蒋泽平，梁珍海，吴纲，等. 秤锤树的组织培养和快速繁殖[J]. 植物生理通讯，2005（4）：197.

[16] 李青林，皱永田，刘广林，等. 木本光赏植物组织培养技术[J]. 河北农业科学，2010 14（6）：38－41.

Experiment on Tissue Culture of Styrax tonkinensis

ZHANG Liang-liang1,2，LIU Xin-hong2，LIN Xin-chun1，LI Yin-gang2，SHI Cong-guang2，LIU Yi-li3，HE Yun-he1*
（1. Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China; 2. Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023, China; 3. Qingtian Forestry Bureau of Zhejiang, Qingtian 323900, China）

Experiments on tissue culture of Styrax tonkinensis was conducted by taking the seeds as explants. The results showed that embryo without endosperm inoculated into medium could produce cotyledons earlier than that with endosperm, as well as reduce the contamination incidence and increase the survival rate. The best medium for propagation was MS medium + 0.3 mg/L of BA, the propagation coefficient reached 5.7, and the average bud length of 4.46 cm. Treatments with 100 mg/L IBA for 3 days had the best root induction effect, topped to 60 % of rooting rate.

Styrax tonkinensis; tissue culture; rapid propagation

S723.1＋32.6

B

1001-3776（2013）03-0016-04

2013-01-16；

2013-04-20

浙江省重大科技专项（优先主题）农业项目（2008C12019）；浙江省创新团队建设与人才培养项目（2010F20014）；浙江省省院合作林业科技项目（2010SY05）；浙江省科技厅公益类项目（2012C22097）

张亮亮（1984－），男，浙江衢州人，硕士生，从事野生植物的开发与应用研究；*通讯作者。