脑血栓患者治疗前后血小板膜糖蛋白CD62p水平的比较

王朝辉 鞠文博 黄竞妍 (北华大学附属医院神经内科，吉林 吉林 132013)

血小板的主要功能就是参与血栓形成，该功能的实现是通过其表面的糖蛋白来完成的，血小板膜表面糖蛋白包括血小板质膜糖蛋白和颗粒膜糖蛋白。较重要的血小板质膜糖蛋白有CD41(GPⅡb，CD61(GPⅢa)，CD42a(GPⅨ)，CD42b(GPIb)，CD36(GPIV)〔1〕。在正常情况下，血小板内α-颗粒膜糖蛋白和溶酶体膜糖蛋白(cD63)处于静息状态，在血小板活化因子等因素刺激下，Q-颗粒膜和溶酶体膜与血小板胞浆膜融合，血小板表面CD62p、CD63表达而成为活化血小板，其黏附、聚集功能显著增强〔2〕。各种因子的作用使静息状态下血小板膜糖蛋白迅速发生数量重排和构型变化，与血浆中相应物质结合而使血小板聚集，同时血小板内发生各种分泌反应，促进血栓形成。这些糖蛋白主要包括CD62p、CD42b、GPⅡb/Ⅲa等，其表达多少，直接反映血小板功能状态。为了确定这些指标的阳性预测值，应用流式细胞术检测血小板膜糖蛋白，即主要检测CD62p、CD42b、GPⅡb/Ⅲa等指标;探讨其在脑血栓疾病的诊断、治疗和预后判断的作用及意义。

1 材料与方法

1.1 对象 本科室脑血栓患者60例(脑血栓组)，男40例，女20例，平均年龄68岁，治疗用药以奥扎格雷为主。对照组为门诊健康查体者60例，平均年龄60岁，男40例，女20例。体检正常，既往无心脑血管、高血压、糖尿病病史，测定前2 w内未服用影响血小板功能的药物。

1.2 主要试剂和仪器 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗CD62p抗体，藻红蛋白(PE)标记的CD42b抗体，均购自美国Bectondickion公司;多聚甲醛，天津科密化学试剂开发中心;磷酸盐缓冲液(PBS)，德国医学实验诊断有限公司。主要仪器:FACSCalibur流式细胞仪、Falocn上样管、CTAD真空采血管均购自美国 Bectondickion公司;KX-21型血细胞分析仪，日本sysmxe公司。

1.3 样品处理 分别在治疗前及治疗后2、4、8 w取静脉血1.8 ml，置于含0.2 ml 3.8%枸橼酸钠抗凝剂离心管中，混匀。离心(800 r/min，5 min)，分离得到富血小板血浆，加入等量2%多聚甲醛(终浓度为1%)固定15 min，用PBS-EDTA缓冲液悬浮血小板并洗涤2次(1 000 r/min，15 min)，然后血小板悬浮于PBS-EDTA缓冲液中并调节血小板浓度为1×1010L－1。

1.4 荧光染色 试验管中加血小板100 μl FITC标记的抗CD62p 抗体20 μl，PE 标记的 CD42b 抗体20 μl混匀，室温下避光 30 min。PBS洗涤2 次(1 000 r/min，15 min)，用0.5 ml PBS悬浮并转移到流式细胞仪，上机检测。

1.5 流式细胞仪检测和数据分析 前向角和侧向角均采用对数放大，设门选取血小板，每份样品收集20 000个血小板，记录其荧光标记抗体的阳性百分比。Cellquest软件分析计算CD42b、CD62p的阳性表达率(%)。

1.7 结果 治疗后2、4、8 w血浆CD62p水平分别为(32.23±8.56)%，(24.25±8.38)%，(12.24±6.38)%，明显低于治疗前〔(50.25±9.82)%〕(P＜0.01)，但均高于对照组〔(3.23±0.56)%〕(P＜0.01)。

2 讨论

动物实验和临床研究〔3〕表明，脑梗死的发生发展涉及多种因素，其中活化血小板在脑血栓的启动、形成和扩展过程中起重要作用，而血浆CD62p是活化血小板特异性标志〔4〕。

CD62P，又称GMP-140，P-选择素，选择素超家族的成员之一，CD62P是一种血小板膜糖蛋白，它选择性地分布于巨核细胞和静止血小板内，非活化血小板胞质内α颗粒含有CD62p，血小板活化时，α颗粒迅速与血小板膜融合并释放CD62p，使后者显露于血小板表面〔5〕。在正常血小板表面仅存在700个分子，血小板受刺激活化后，α颗粒迅速与血小板膜融合并释放，使CD62p重新分布于血小板表面，且CD62p只在活化血小板表面表达，不被血浆蛋白质所掩盖，不随时间推移而在活化血小板表面消失，血小板表面CD62p可反映血小板的活化状态，所以CD62p的表达是血小板活化的特征性指标〔6〕。

CD62p也整合到血小板膜上，介导血小板与单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞的黏附，故CD62p是活化血小板或内皮细胞与白细胞相互作用的主要桥梁。通过进一步研究发现，CD62p也是中性白细胞和单核细胞的受体，通过CD62p参与调节细胞黏附过程，使血小板与中性白细胞黏附、聚集、加固、并机化血栓。另外，当血小板或内皮细胞活化时，CD62p还可以释放到血浆中，血浆中的CD62p含量的测定也反映体内血小板活化程度及血栓形成倾向。近年来研究同时表明CD62p作为细胞膜表面的黏附分子，能介导血小板和血管内皮细胞与中性粒细胞〔7〕，单核细胞间的相互黏附、聚集。具有启动、放大血栓形成的重要作用，在炎症和栓塞中起着中心环节作用〔8〕。

因此利用CD62p这一特征观察或鉴别患者体内血小板、内皮细胞激活状态。对炎症损伤、血栓性疾病等临床研究、疾病诊断与治疗均具有重要意义〔9〕。最初一些学者在自身免疫性疾病(系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、混合性结缔组织病)，糖尿病及肾脏疾病等进行血浆CD62p检测，发现有不同程度增高，后来研究发现在血栓形成尤见，但正常人血浆中也有可溶性CD62p，但浓度相对较低 。

脑血栓疾病是因不同原因导致脑血管中流动的血液变成固体，致使血流发生不同程度受阻后形成的综合病征。

流式细胞术检测血小板活化具有简便、快速等优点，且能准确反映出血小板活化程度及功能状态，可作为血小板活化研究重要手段〔11，12〕。本实验提示临床检测CD62p具有诊断和治疗意义。

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8 Davis SM，Lees KR，Alber S，et al.Selfotel in a cute ischemie stroke:Possible neurotoxic effects of a NMDA antagonist〔J〕.Stroke，2000;31:347-54.

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11 俎德玲，诸葛毅，蒋一鸣，等.急性心肌梗死患者血小板活化标志物与超微结构的变化〔J〕.中华急诊医学杂志，2011;20(1):74-7.

12 李天君，赵 锋，张印则，等.血小板功能特性质量检测方法学研究〔J〕.临床和实验医学杂志，2011;10(10):727-9.