时间分辨荧光免疫分析技术在真菌毒素检测的应用①

王 坤 侯玉泽 胡骁飞 王 耀 李文君 裴亚峰 邓瑞广

(河南科技大学食品与生物工程学院，洛阳471003)

近些年，生物标记技术不断的发展，免疫分析技术得到了快速的发展。例如放射免疫分析技术，由于放射分析技术存在污染性和局限性，限制其进一步发展与应用，继由放射免疫分析技术之后，又研究形成了各种非放射免疫技术，包括酶标记分析技术、荧光免疫分析技术、化学发光免疫分析技术、时间分辨荧光免疫分析(Time-resolved fluoreimmuoassay，TRFIA)技术等。但是，从灵敏度上来说只有TRFIA技术可与放射免疫分析媲美。TRFIA是20世纪80年代迅速发展起来的一种被公认为最有发展前途的一种非放射标记分析技术[1]。

1 TRFIA的技术原理和优势

1.1 TRFIA的技术原理 TRFIA是用具有特殊荧光的镧系离子与螯合剂结合作为示踪物标记蛋白质、多肽、激素、抗体等，在一定的反应体系(如:抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等)发生反应后，用时间分辨荧光仪测定产物中的特异荧光强度，推测反应体系中分析物的浓度，从而达到对待测物质进行定量分析的目的[2，3]。

1.2 TRFIA的优势 TRFIA技术具有酶标记分析技术和同位素标记技术的优点:具有灵敏度高、特异性强、稳定性好，且测定范围宽，试剂寿命长，操作简便和非放射性等特点[4]。优势有以下几点:

一般荧光物质光谱的Stokes位移非常的小，只有几十纳米[5]，导致激发光谱和发射光谱通常有部分重叠，互相干扰严重。但是镧系离子与螯合剂形成螯合物后，Stokes位移能够达到200 nm以上，很容易分辨激发光和发射光，从而激发光干扰就可以排除了。

镧系元素与通常的荧光物质相比较，镧系元素离子螯合物荧光的衰变时间要长的多，为传统荧光的103～106倍。在用时间分辨荧光仪测量荧光时，可以适当的延迟一段时间，待其它物质的荧光衰变后再测量，这时只测量Eu3+标记物的特异性荧光，即通过TRFIA技术，极大地降低了本底荧光，这是TRFIA高灵敏度和低干扰的原因之一[6]。

镧系螯合物激发光光谱比较宽，通常在300～500 nm，可通过增加激发光能量来提高灵敏度。而它的发射光谱带很窄，甚至不到10 nm，可采用只允许发射荧光通过的滤光片，进一步降低本底荧光，这样可以大大的提高检测的灵敏度。

镧系离子与双功能螯合剂螯合后，可形成稳定的螯合物，稳定性非常高，生产出的产品保质期可以长达2年。而酶标记物常因其纯度、显色底物不稳定等问题，使其应用受到限制。再者，Eu3+标记物体积很小(为原子标记)，标记后不会影响被标记物的空间立体结构，这既保证了被检测物质的稳定性(尤其对蛋白质影响更小)，又可实现多位点标记，这样可以实现一个试剂盒能够同时检测出两种或两种以上的物质，这样不但简便还大大降低了成本。

2 时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)在真菌毒素检测方面的应用

真菌毒素(M ycotoxins)是由产毒真菌(主要为曲霉属、青霉属及镰孢属)在适宜的环境条件下产生的具有很强毒性的二级代谢产物，它主要对食品、农作物及饲料等污染很严重[7]。真菌毒素大约每年会污染将近25%的农产品，造成了巨大的经济损失。当这些被污染的农产品被人和动物摄入后会产生很多种疾病，严重威胁着人类与动物的生命与健康[8]。当前，最主要的真菌毒素主要有:黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马菌素、T-2毒素、展青霉素、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇等。

在当今世界上，食品安全和粮食安全问题已经成为我们日常生活关注的焦点问题之一。对真菌毒素限制正在逐步加强，限量标准也在不断降低，所以更需要找到一种灵敏度高，特异性强，简便快速容易普及应用的方法来检测真菌毒素。目前，真菌毒素的测定方法有TLC法、HPLC法[9]等，这些方法都不同程度地存在着样品前处理过程复杂、毒性大、所需时间长等缺点。由于其他荧光物质、色素、结构类似物对检测产生干扰，必须通过液-液萃取进行净化处理，操作烦琐，有机试剂用量大，提取效率低，环境污染严重。ELISA法灵敏、且快速、低成本，但ELISA是一种定性或半定量的方法，当选择的不同单克隆抗体，会造成结果存在一定的误差，所以这种定量，相对不太准确。TRFIA具有排除其他荧光干扰，灵敏度高，一次可以测多个样品的优势，将成为检测真菌毒素的主要方法。

2.1 黄曲霉毒素

2.1.1 黄曲霉毒素的性质、危害及限量标准 黄曲霉毒素(Aflatoxin，AF)由黄曲霉和寄生曲霉产生的次生代谢产物。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)划定为Ⅰ类致癌物，主要作用于肝脏[10]。由于黄曲霉毒素的危害性比较大和分布比较广泛，联合国的相关组织(像WHO、FAO、UNEP等)曾多次组织调研并提出了对应的控制措施和标准。在1995年世界卫生组织规定了食品中AFB1的含量不能超过15 μg/kg，在婴儿食品中不能检出[11];美国联邦政府也出台了相关法律，规定了食品和饲料中总的黄曲霉毒素含量不得超过15 μg/kg;欧盟国家的规定更加的严格，规定了日常生活食用品中的AFB1的含量不得超过2 μg/kg，总量不超过4 μg/kg，最近已将部分食品中的AFB1的含量限定在0.1 μg/kg以内。我国对AFB1的污染和控制也非常重视[12]，在1982年颁布了粮油和发酵食品中的AFB1允许量标准。规定大米、食用油中AFB1的含量不超过10 μg/kg，其他粮食、豆类及发酵食品的含量不能超过5 μg/kg。

2.1.2 AFB1-TRFIA检测方法的建立 黄飚等[13]采用时间分辨荧光技术建立了高灵敏的黄曲霉毒素Bl(AFB1)间接竞争免疫分析法(AFB1-TRFIA)。该方法的灵敏度为0.01 μg/kg，测量范围为0.01～100 μg/kg，批内和批间的变异率为4.1%和6.8%，平均回收率为97.2%，远远高于ELISA试剂盒检测。计融等[14]利用间接竞争ELISA方法，研制黄曲霉毒素ELISA检测试剂盒。该试剂盒最低检出浓度为 0.26 μg/kg，对样品的最低检出量为 1.5 μg/kg。采用AFB1-TRFIA技术检测的灵敏度和测量宽度较ELISA结果都好，其灵敏度高，测量范围很宽，这样既可以符合食品中AFB1较低浓度的限量标准，也能够符合饲料中AFB1较宽范围的限量标准，是一种简便、快速、经济的并可以进行大批量样品检测的方法。黄飚等[15]又采用时间分辨荧光免疫分析技术，建立黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的高灵敏的TRFIA的检测方法，并且研制出具有我国自主知识产权的快速、灵敏的AFB1-TRFIA、OTA-TRFIA检测试剂盒。结果该方法检测黄曲霉毒素B1的灵敏度为0.02 μg/L，测量范围为0.02 ～100 μg/L，检测赭曲霉毒素A的灵敏度为0.05 μg/L，测量范围为0.05～50 μg/L，这种方法灵敏度高，稳定性好，可测范围宽，一次操作同时可以得到AFB1、OTA的两个结果，是一种简单、经济、稳定的检测方法。

2.2 赭曲霉毒素

2.2.1 赭曲霉毒素的性质、危害及限量标准 赭曲霉毒素(Ochratoxin，OT)是赭曲霉属和青霉属的几种真菌分泌产生的次级代谢产物。主要对农作物、动物和人有毒害作用的物质，其中以赭曲霉毒素A(OTA)毒性和危害是最大的，对农作物的污染最严重、分布也是最广泛的[16]。OTA主要毒害人和动物的肾脏及肝脏，有致畸、免疫抑制和致癌作用，国际癌症研究机构IARC把它认定为2B类致癌物，对农作物、动物和人都有很大的毒害作用。因此各国对各类食品中OTA的限量标准很严格，如欧盟国家在谷物中不得超过5 μg/kg，在谷物制品中不得超过3 μg/kg，在干鲜果品中不得超过 10 μg/kg[17]。

2.2.2 OTA-TRFIA检测方法的建立 黄飚等[18]采用稀土离子标记技术，应用多克隆抗体建立高灵敏的赭曲霉毒素A(OTA)时间分辨荧光免疫分析法(OTA-TRFIA)。以OTA-KLH为免疫原制备抗OTA抗体;OTA与BSA的联结物(OTA-BSA)为固相抗原，与游离OTA共同竞争有限的兔抗OTA抗体;用Eu3+标记的羊抗兔抗体。该方法的灵敏度为0.02 μg/L，测量范围为0.02 μg/L ～400 μg/L，批内和批间的变异率分别为2.6%和5.2%，平均回收率为95.8%，与赭曲霉毒素B对OTA的检测有5.6%交叉反应，而黄曲霉毒素B1及BSA则没有交叉反应。不同时间进行的OTA-TRFIA的ED80、ED50、ED20效应点值分别为 0.2 μg/L、1.0 μg/L 和 5.3 μg/L。试验研究表明，OTA-TRFIA是目前在OTA检测中最灵敏和简便的方法之一，该分析方法具有稳定性好、可测范围宽等优点，具有很好的应用前景。

2.3 伏马菌素

2.3.1 伏马菌素的性质、危害及限量标准 伏马菌素(Fumonisin，FB)是一种霉菌毒素，是由串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme Sheld)产生的水溶性代谢产物。流行病学调查显示人类食管癌与伏马菌素污染有关，国际癌症研究中心(IARC)把它划分到2B组，即人类有可能致癌的物质[19]。伏马菌素分布广泛且毒性较大，越来越受到人们的关注。美国食品药品监督管理局(FDA)公布的食用谷物中伏马菌素的推荐最高限量为2 mg/kg[20]，欧盟公布不同饲料中伏马菌素的推荐最高限量标准为5 mg/kg。

2.3.2 FB1-TRFIA检测方法的建立 张珏等[21]利用稀土离子Eu3+-羊抗鼠IgG进行示踪检测，建立伏马毒素B1-时间分辨荧光免疫分析(FB1-TRFIA)并进行方法学的考核。结果FB1-TRFIA检测灵敏度为0.05 ng/ml，检测范围为 FB1:1.0 ～1 000 ng/ml，批内、批间变异率均小于10%。添加回收实验表明玉米样品中FB1批内平均回收率为104.3%，批间平均回收率为100.7%。FB1与FB2有轻微交叉反应，FB1不与赤霉毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、T-2等真菌毒素发生交叉反应，方法特异性好。结论:FB1-TRFIA灵敏度高，检测范围宽，重复性、稳定性好，是一种简便、快速、经济、稳定、可进行大批量样品伏马毒素筛查的检测方法。

2.4 T-2毒素

2.4.1 T-2毒素的性质、危害及限量标准 T-2毒素(T-2 toxin)是单端孢霉烯族毒素之一，可由多种真菌产生，主要产生菌是镰孢菌属，如拟枝孢镰刀菌、枝孢镰刀菌等[22]。1973年联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)在日内瓦召开的联席会议上，把这类毒素同黄曲霉素一样作为自然存在的最危险的食品污染源。它分布范围广(尤其是玉米和小麦)、毒性强，且证明其与克山病和大骨节病有关[23]。以色列规定谷物饲料中T-2毒素不得超过100 ppb;我国《配合饲料中T-2毒素的允许量(GB 21693-2008)》规定，在猪、禽配合饲料中，T-2毒素的允许量必须≤1 mg/kg，即≤1 ppm(1 000 ppb)。

2.4.2 T-2-TRFIA检测方法的建立 杨润琳等[24]以时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)方法建立快速灵敏的T-2毒素的全自动检测方法。采用T-2-BSA包被96孔板作为固相抗原，与游离的T-2竞争有限的抗T-2单克隆抗体，以Eu3+标记的羊抗鼠抗体示踪，采用间接竞争免疫分析方法在解离增强荧光免疫分析体系中建立T-2-TRFIA。同时对这一方法的稳定性、灵敏度、回收率和特异性进行考核。此方法灵敏度为0.2 μg/L，测量范围0.2 ～500 μg/L，批内变异为7.5%，批间变异为12.7%，平均回收率为89.6%。与赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1、牛血清白蛋白无交叉反应。10条不同时间进行的间接竞争T-2-TRFIA的效应点均值ED80、ED50、ED20分别为 2.66、6.97、29.11 μg/L。本试验建立的间接T-2-TRFIA方法所需时间短，分析系统高度自动化，操作简便，人为误差低，稳定性高，可测范围广，灵敏度高，适合于快速、简便、大批量的样品筛查。

2.5 玉米赤霉烯酮

2.5.1 玉米赤霉烯酮的性质、危害及限量标准 玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)又叫F-2毒素，是由串珠镰刀菌、粉红镰刀菌及三线镰刀菌等镰刀菌株产生的一种雌激素真菌毒素。研究表明，猪对玉米ZEN最为敏感。高剂量的ZEN还能引起人的雌激素水平升高，并产生相应的生殖紊乱症状[25]。因此，各国政府相继出台制定出了ZEN在动物饲料和粮食中的最高限量[26]。澳大利亚规定谷物中的ZEN的含量不能超过50 ppb;意大利规定在谷物和谷类产品中ZEN的含量不能超过100 ppb;法国规定植物油和谷类当中ZEN的含量必须低于200 ppb;欧盟规定仔猪日粮中ZEN的最高限量为100 ppb;我国《饲料卫生标准饲料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允许量(GB 13078.2-2006)》规定配合饲料和玉米中ZEN的最高限量为500 ppb。

2.5.2 ZEN-TRFIA检测方法的建立 马智鸿等[27]采用基于生物素(Biotin)-链霉亲和素(Strepavidin)的时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术建立了快速灵敏的玉米赤霉烯酮(ZEN)检测方法。以Strepavidin包被板条，加入生物素化的ZEN-BSA，结合在板条上的ZEN-BSA与标准/样本中的游离ZEN共同竞争限量的抗ZEN单克隆抗体，用稀土离子Eu3+标记的羊抗鼠IgG进行示踪，建立了间接竞争的ZEN-TRFIA。该方法的检测灵敏度为0.2 ng/ml，测量范围是0.2～200.0 ng/ml，批内和批间变异率分别为5.7%和8.3%，平均回收率达到了91.1%。与玉米赤霉醇的平均交叉反应为12.3%，与黄曲霉素B1、赭曲霉素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇均无交叉反应，说明该方法的特异性非常好。试验中用到的试剂在4℃放6个月后各项检测参数几乎没有变化，说明该方法稳定性很好。ZEN-TRFIA具有测量准确、检测灵敏度高、检测范围宽、操作简便、标记物稳定等优点，适合于ZEN大量筛查的应用。

2.6 脱氧雪腐镰刀菌烯醇

2.6.1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的性质、危害及限量标准 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)是一种单菌孢霉烯族化合物，DON主要污染玉米、大麦、小麦等谷类作物及制品，对人畜有很强的毒性[28]，1993年国际癌症研究中心(IARC)将DON列为第三类致癌物。因此，各国都对谷物及饲料中DON的含量制定了严格的限量标准，例如，美国FDA规定小麦及其制品中DON的含量不得超过1.0 mg/kg，饲料中 DON 不得超过 4.0 mg/kg[29]。我国国家标准GB2761-2005规定在食用小麦及玉米中DON的限量为1 000 μg/kg，GB20833-2007规定猪饲料中DON的允许量为1 000 μg/kg;联合国粮农组织规定食用粮食中DON的含量必须＜1000 μg/kg。

2.6.2 DON-TRFIA检测方法的建立 周彬等[30]利用抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)多克隆抗体，采用纳米均相时间分辨荧光免疫法测定技术建立间接竞争DON-TRFIA定量检测方法。方法:DON-BSA包被发光微粒，生物素化羊抗兔抗体与包被有链霉素的感光微粒共同构成检测试剂，优化检测各种条件并对检测性能进行评价。结果:该方法的灵敏度为0.007 ng/ml，检测范围为 0.007 ～100 ng/ml，批内批间变异系数均＜5%。不同样品添加回收实验:玉米、小麦、啤酒回收率分别为 84% ～110%、67% ～100%、74% ～100%。结论:纳米均相时间分辨荧光免疫法测定DON是目前DON检测中最灵敏的方法之一，该分析方法稳定性好，可测范围宽，具有很好的应用前景。

3 结语

综上所述，真菌毒素是一类毒性很强的小分子物质，性质非常稳定，不会因为在加热的情况下被破坏，并且对农作物、饲料和食品污染很严重，这些都与我们日常生活和生命健康有非常大的关联，也对畜禽的生长和肉类产品有重大的影响。对人畜的危害性主要表现在导致各种急性、慢性中毒现象的发生，而且还存在致癌、致畸、致突变的危险。随着人们生活水平的日益提高，解决真菌毒素可能造成的污染不仅关系到食品安全和人们的健康，而且还关系到畜禽肉类产品的健康发展。真菌毒素对人类生活的污染往往不易被人们所注意，因此更需要找到一种灵敏度高，特异性强，简便快速容易普及应用的方法来检测真菌毒素。TRFIA技术是近些年新兴起的一种快速免疫检测技术，它集合了酶标记技术、放射标记技术和同位素标记技术的优点，具有灵敏度高、特异性很强、稳定性好，且测定范围更宽，试剂盒寿命长，操作简单和非放射性等特点，非常适用于真菌毒素的超微量分析，是一项很有前途的、值得推广使用的技术，其应用范围不断发展已经成为食品安全检测方面的重要手段。

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