肝康复合剂的化学成分研究

张进才， 陈光英， 韩长日， 陈文豪， 陆景莉， 平媛媛

(海南师范大学“省部共建－热带药用植物化学”教育部重点实验室，化学与化工学院，海南海口 571158)

肝康复合剂是海南省定安地区广传于民间的经验方，由火炭母、大青和盘上芫茜组成，民间用于治疗急性黄疸型肝炎，具有退黄保肝功效。采用α－萘异硫氰酸酯 (ANIT)灌胃给药建立小鼠实验性黄疸模型，以小鼠血清总胆红素 (TBIL)和谷丙转氨酶 (ALT)水平为指标，并以茵栀黄颗粒为阳性对照，观察75%乙醇提取物及不同极性提取部位 (石油醚提取物、三氯甲烷提取物和水提取物)对小鼠血清TBIL和ALT的影响，评价其退黄保肝作用。结果表明:75%乙醇粗提取物和三氯甲烷部位对ANIT所致小鼠实验性黄疸模型具有较好的退黄保肝作用。此结果表明该方对治疗急性黄疸型肝炎有较显著的效果［1］。为了阐明该方的药效物质基础，本实验对该方的化学成分进行了初步研究。

1 仪器和材料

XT5—10显微熔点测定仪 (温度未校正);Bruker AV—400 MHz超导核磁共振仪 (瑞士Bruker公司);Agilent HCT—1200液质联用仪;2695型高效液相色谱仪 (Waters分析仪器有限公司);EZ Purifier中低压制备色谱 (上海利穗化工科技有限公司);正相硅胶 (青岛海洋化工厂);Sephadex LH—20(美国Pharmacia公司);C18反相硅胶填料(YMC公司)。所用试剂均为分析纯。

火炭母、大青、盘上芫茜于2009年采于海南省定安县，经海南师范大学生命科学学院钟琼芯副教授鉴定分别为蓼科蓼属植物火炭母Polygonum chinenseLinn.的叶、马鞭草科大青属植物大青Clerodendron cyrtophyllumTurcz的根、伞形科天胡荽属植物天胡荽Hydrocotyle sibthorpioidesLam.全草。标本保存于海南师范大学省部共建－热带药用植物化学教育部重点实验室。

2 提取与分离

按肝康复合剂处方比例称取各药材共10 kg，用75%乙醇浸泡，加热回流提取3次，合并提取液，减压浓缩，得黑色浸膏。浸膏用水溶解后用等体积的石油醚、三氯甲烷反复多次萃取。萃取液减压浓缩得石油醚部位104 g，三氯甲烷部位145 g。三氯甲烷部位萃取物经常压硅胶色谱柱层析，依次用石油醚－乙酸乙酯 (50∶1→1∶1，V/V)和三氯甲烷－甲醇 (50∶1→1∶1，V/V)进行梯度洗脱，得到A～G共7个组分。组分A经石油醚－乙酸乙酯 (45∶1→1∶1，V/V)，得到A1～A55个组分，组分A1经析出后得到化合物2(150 mg);组分A4经石油醚－三氯甲烷 (3∶1，V/V)洗脱，得到化合物3(380 mg)、4(5.3mg)、5(4 mg);组分B中重结晶得到大量无色细针状结晶得到化合物1(1.5g);组分C经三氯甲烷－乙酸乙酯 (45∶1→1∶1，V/V)，得到C1～C33个组分，C2经三氯甲烷－丙酮 (15∶1，V/V)洗脱，再经制备薄层色谱纯化得到化合物6(10 mg);C3经三氯甲烷－丙酮(15∶1，V/V)洗脱，经半制备HPLC得到化合物7(13 mg)、8(5 mg)、9(4 mg);组分E通过硅胶柱层析，以三氯甲烷－甲醇体系梯度洗脱 (50∶1→1∶1，V/V)，再经半制备HPLC得到化合物10(185 mg)、11(5 mg)、12(70 mg);组分G通过制备HPLC(甲醇－水，70∶30)制备分离，经葡聚糖凝胶LH－20(洗脱剂:甲醇)纯化，得到化合物13(3 mg)、14(3 mg)、15(5 mg)。

3 结构鉴定

化合物1:白色针状结晶，mp 140～142℃，5%硫酸－乙醇溶液显色为紫红色，TLC上多种溶剂系统展开时化合物与对照品β－谷甾醇的Rf值相同，混和后熔点不下降，故鉴定为β－谷甾醇。

化合物2:白色絮状粉末，mp 63～64℃，ESI－MSm/z255 ［M－H］－。1H－NMR(400MHz，CDCl3)δ:2.34(2H，t，J=7.2 Hz，H－2)，1.63(2H，pent，J=6.8Hz，H－3)，1.25(24H，brs)，0.88(3H，t，J=7.2 Hz，H－16)。13C－NMR(100 MHz，CDCl3)δ:180.1(C－1)，34.2(C－2)，24.7(C－3)，29.1(C－4)，29.4(C－5)，29.5(C－6)，29.6(C－7)，29.7(C－8)，29.7(C－9)，29.7(C－10)，29.7(C－11)，29.7(C－12)，29.3(C－13)，32.0(C－14)，22.7(C－15)，14.1(C－16)。以上数据与文献［2］报道一致，故鉴定化合物2为棕榈酸 (palmic acid)。

化合物3:白色固体粉末，ESI－MSm/z415［M+H］+。1H－NMR(400 MHz，CD3OD)δ:0.82(3H，d，J=6.4 Hz，H－27)，0.85(3H，s，H－18)，0.99(3H，d，J=6.4 Hz，H－19)，1.07(3H，s，H－21)，5.38(1H，d，H－6)。13C－NMR(100 MHz，CD3OD)δ:37.9(C－1)，32.5(C－2)，72.4(C－3)，43.1(C－4)，142.3(C－5)，122.3(C－6)，33.2(C－7)，32.3(C－8)，51.7(C－9)，37.9(C－10)，22.0(C－11)，41.0(C－12)，41.5(C－13)，57.8(C－14)，32.8(C－15)，82.3(C－16)，63.8(C－17)，16.8(C－18)，19.9(C－19)，43.0(C－20)，14.9(C－21)，110.6(C－22)，31.5(C－23)，29.9(C－24)，30.9(C－25)，67.9(C－26)，17.5(C－27)。以上数据与文献［3］报道一致，故鉴定化合物3为薯蓣皂苷元。

化合物4:白色晶体，mp 316～318℃，ESIMSm/z455 ［M－H］－。1H－NMR(400 MHz，DMSO－d6)δ:4.69(1H，d，J=2.0 Hz，29－CH2)，4.56(1H，d，J=2.0 Hz，29－CH2)，3.16(1H，dd，J=7.2，9.2 Hz，H－3)，1.63(3H，s，30－CH3)，0.93(3H，s，27－CH3)，0.87(6H，s，23，26 －CH3)，0.76(3H，s，25－CH3)，0.65(3H，s，24－CH3)。13C－NMR(100 MHz，DMSO－d6)δ:38.2(C－1)，27.8(C－2)，77.4(C－3)，38.9(C－4)，55.5(C－5)，18.6(C－6)，34.6(C－7)，39.1(C－8)，50.6(C－9)，37.4(C－10)，21.1(C－11)，25.7(C－12)，37.0(C－13)，42.6(C－14)，27.8(C－15)，29.8(C－16)，47.2(C－17)，49.7(C－18)，49.2(C－19)，152.0(C－20)，30.8(C－21)，32.4(C－22)，28.7(C－23)，15.0(C－24)，16.4(C－25)， 16.6(C－26)， 14.7(C－27)，173.2(C－28)，110.2(C－29)，19.6(C－30)。以上数据与文献［4］报道基本一致，故鉴定化合物4为桦木酸。

化合物5:棕黄色粉末，mp 283～285℃，ESI－MSm/z455 ［M－H］－。1H－NMR(400 MHz，CD3OD)δ:0.72(3H，s，H－26)，0.81(3H，s，H－25)，0.84(3H，d，J=7.0 Hz，H－29)，1.11(3H，s，H－27)，1.06(3H，s，H－23)，1.05(3H，s，H－24)，5.22(1H，d，J=7.0 Hz，H－12)。13C－NMR(100 MHz，CD3OD)δ:30.5(C－1)，26.8(C－2)，77.4(C－3)，48.9(C－4)，55.5(C－5)，18.5(C－6)，34.6(C－7)，47.6(C－8)，36.4(C－10)，23.1(C－11)，125.8(C－12)，137.0(C－13)，42.6(C－14)，30.8(C－15)，34.8(C－16)，47.7(C－18)，53.2(C－19)，39.2(C－20)，30.9(C－21)，36.4(C－22)，28.8(C－23)，15.0(C－24)，16.4(C－25)，22.7(C－26)，180.2(C－27)，17.9(C－29)，21.7(C－30)。以上数据与文献［5］报道一致，故鉴定化合物5为乌苏酸。

化合物6:白色长针状结晶，mp 118～120℃，ESI－MSm/z411 ［M+H］+。1H－NMR(400 MHz，CDCl3)δ:5.73(1H，s，H－4)，1.20(3H，s，H－19)，0.93(3H，d，J=6.5 Hz，H－21)，0.86(3H，t，J=7.5 Hz，H－29)，0.84(3H，d，J=8.0 Hz，H－26)，0.82(3H，d，J=7.0 Hz，H－27)，0.73(3H，s，H－18)。13C－NMR(100 MHz，CDCl3)δ:35.6(C－1)，33.3(C－2)，199.5(C－3)，123.6(C－4)，171.5(C－5)，33.7(C－6)，32.4(C－7)，35.6(C－8)，53.2(C－9)，38.5(C－10)，21.0(C－11)，39.4(C－12)，42.7(C－13)，55.8(C－14)，24.3(C－15)，28.1(C－16)，56.1(C－17)，11.9(C－18)，17.3(C－19)，36.3(C－20)，18.7(C－21)，33.8(C－22)，26.4(C－23)，45.3(C－24)，23.0(C－25)，19.8(C－26)，29.3(C－27)，19.0(C－28)，11.7(C－29)。以上数据与文献［6］报道的数据基本一致，故鉴定化合物 6 为豆甾－4－烯－3－酮。

化合物 7:白色块状固体，ESI－MSm/z321［M－H］－。1H－NMR(400 MHz，DMSO－d6)δ:2.55(3H，s，H－15)，3.76(1H，t，J=11.2 Hz，H－6)，3.85(1H，m，H－6α)，4.33(1H，dd，J=11.2，4.4 Hz，H－6')，5.85(1H，d，J=7.6 Hz，H－11α)，6.29(1H，d，J=2 Hz，H－4)，6.53(1H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H－2)，7.23(1H，d，J=8.4 Hz，H－8)，7.36(1H，d，J=8.4 Hz，H－1)，7.56(1H，d，J=8.4 Hz，H－7)，7.90(1H，s，H－12)，9.74(1H，s，C－3－OH)。13CNMR(100 MHz，DMSO－d6) δ:132.2(C－1)，111.2(C－1a)，109.8(C－2)，158.9(C－3)，102.9(C－4)，156.6(C－4a)，66.0(C－6)，39.3(C－6a)，124.8(C－7)，120.9(C－7a)，103.8(C－8)，153.6(C－9)，112.2(C－10)，156.7(C－10a)，79.8(C－11a)，110.9(C－12)，151.8(C－13)，187.5(C－14)，26.2(C－15)。以上数据与文献［7］报道一致，故鉴定化合物 7为crotafuran B。

化合物8:浅棕色结晶，mp 72～75℃，ESIMSm/z148 ［M－H］－。1H－NMR (400MHz，CDCl3)δ:9.77(1H，s，－CHO)，7.77(2H，d，J=8.8 Hz，H－2，6)，6.75(2H，d，J=8.8 Hz，H－3，5)，3.12(6H，s，－N(CH3)2)。13C－NMR(100 MHz，CDCl3)δ:125.3(C－1)，132.0(C－2，C－6)，111.2(C－3， C－5)，154.3(C－4)，190.4(－CHO)，40.2 ［－N(CH3)2］。以上数据与文献［8］报道一致，故鉴定化合物8为4－二甲氨基苯甲醛。

化合物9:浅黄色晶体，mp 297～298℃，ESI－MSm/z271 ［M+H］+。1H－NMR(400 MHz，acetone－d6) δ:13.02(1H， s， 5－OH)， 8.15(1H，s，H－2)，7.45(2H，dd，J=8.4，2.8 Hz，H－2'，6')，6.89(2H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H－3'，5')，6.40(1H，d，J=2.0 Hz，H－8)，6.28(1H，d，J=2.0 Hz，H－6)。13C－NMR(100MH，acetone－d6) δ:154.1(C－2)， 122.9(C－3)，181.5(C－4)，163.8(C－5)，99.8(C－6)，165.2(C－7)，94.4(C－8)，105.9(C－4α)，159.0(C－8α)，123.0(C－1')，131.9(C－2')，115.9(C－3')，158.3(C－4')，115.9(C－5')，131.1(C－6')。以上数据与文献［9］报道的数据基本一致，故鉴定该化合物9为染料木素。

化合物10:白色固体粉末，ESI－MSm/z356［M+H］+。1H－NMR(400 MHz，CDCl3)δ:6.91(1H，d，J=8.4 Hz，H－4)，6.89(1H，d，J=8.4Hz， H－1)，6.76(1H， s， H－11)，6.65(1H，s，H－12)，4.29(1H，d，J=16 Hz，H－14)，3.92(3H，s，9－OCH3)，3.90(3H，s，10－OCH3)，3.88(6H， s，2，3－OCH3)，3.60(2H，m，H－8)，2.90(1H，m， H－5)，2.66(2H，m，H－6)。13C－NMR(100 MHz，CDCl3)δ:108.7(C－1)， 147.7(C－2)， 147.6(C－3)，111.5(C－4)，29.9(C－5)，51.5(C－7)，53.9(C－8)，127.8(C－8α)，150.4(C－9)，145.2(C－10)， 111.2(C－11)， 123.9(C－12)， 59.3(C14)，55.9(C－2－OCH3)，55.9(C－3－ OCH3)，60.2(C－9－OCH3)，56.2(C－10－OCH3)。以上数据与文献［10］报道一致，故鉴定化合物10为tetrahydropalmatine。

化合物11:白色针晶，mp 80～81℃，ESI－MSm/z151 ［M－H］－。1H－NMR(400 MHz，CDCl3)δ:9.77(1H，s，－CHO)，7.40(1H，dd，J=8.1，1.8 Hz，H－6)，7.38(1H，d，J=1.8 Hz，H－2)，6.99(1H，d，J=8.1 Hz，H－5)，3.90(3H，s，－OCH3)。13C－NMR(100 MHz，CDCl3)δ:129.9(C－1)，108.8(C－2)，147.2(C－3)，151.7(C－4)， 114.4(C－5)， 127.6(C－6)， 190.9(－CHO)，56.4(－OCH3)。以上数据与文献［11］报道基本一致，故鉴定化合物11为香草醛。

化合物12:浅黄色结晶粉末，mp 208～210℃，ESI－MSm/z167 ［M－H］－。1H－NMR(400 MHz，CD3OD)δ:9.85(1H，s，－COOH)，7.46(1H，dd，J=8.1，1.8 Hz，H－6)，7.45(1H，d，J=1.8 Hz，H－2)，7.08(1H，d，J=8.1 Hz，H－5)，3.99(3H， s，－OCH3)。13C－NMR(100 MHz，CD3OD)δ:123.1(C－1)，113.8(C－2)，152.6(C－3)， 148.6(C－4)， 115.8(C－5)，125.3(C－6)，170.1(－COOH)，56.4(－OCH3)。以上数据与文献［12］报道一致，故鉴定化合物12为香草酸。

化合物13:橙色晶状固体，mp 256～257℃，EMS－MSm/z271 ［M+H］+。1H－NMR(400 MHz，CD3OD)δ:7.58(1H，s，H－4)，7.18(1H，d，J=2.4 Hz，H－5)，7.11(1H，s，H－2)，6.54(1H，d，J=2.4 Hz，H－7)，2.46(3H，s，3－CH3)。13C－NMR(100 MHz，CD3OD) δ:161.2(C－1)，123.8(C－2)，148.2(C－3)，120.0(C－4)，132.8(C－4α)，108.7(C－5)，134.6(C－5α)，165.5(C－6)，107.9(C－7)，164.5(C－8)，108.3(C－8α)，189.6(C－9)，181.2(C－10)，21.3(3－CH3)。以上数据与文献［13］报道的数据基本一致，故鉴定该化合物13为大黄素。

化合物14:白色粉末，mp 96～98℃。ESI－MSm/z285 ［M－H］－。1H－NMR(400 MHz，CD3OD)δ:7.26(2H， d，J=8.4Hz， H－3'，5')，7.02(2H，d，J=8.4 Hz，H－2'，6')，4.48(2H，s，H－4')，5.03(1H，d，J=7.6 Hz，H－1)，3.82(1H，dd，J=7.6，2.0 Hz，H－2)，3.46(1H，m，H－3)，3.39(1H，m，H－4)，3.65(1H，m，H－5)，3.52(2H，m，H－6)。13C－NMR(100 MHz，CD3OD) δ:156.4(C－1)，116.6(C－2，6)，129.2(C－3，5)，134.9(C－4)，63.3(－CH2OH)，100.1(C－1')，75.5(C－2')，72.9(C－3')，69.4(C－4')，76.1(C－5')，60.5(C－6')。以上数据与文献［14］报道的数据基本一致，故鉴定该化合物14为天麻素。

化合物15:白色晶状粉末，mp 223～226℃，ESI－MSm/z391 ［M+H］+。1H－NMR(400 MHz，CD3OD) δ:7.10(2H，d，J=8.4 Hz，H－2'，6')，6.67(2H，d，J=8.4 Hz，H－3'，5')，6.41(2H，s，H－2，4)，6.48(1H，s，H－6)，6.36(1H，d，J=12.0 Hz，H－7)，6.52(1H，d，J=12.0 Hz，H－8)。13C－NMR(100 MHz，CD3OD)δ:141.1(C－1)， 109.2(C－2)， 160.1(C－3)，103.9(C－4)， 159.5(C－5)， 111.1(C－6)，129.9(C－1')，131.4(C－2'，6')，116.2(C－3'，5')，158.0(C－4')，102.3(C－1″)，74.9(C－2″)，78.0(C－3″)，71.1(C－4″)，77.8(C－5″)，62.2(C－6″)。以上数据与文献［15］报道的数据基本一致，故鉴定化合物15为云杉新苷。

4 讨论

肝炎已成为严重危害人类健康的大敌。尽管目前治疗肝炎的药物较多，然而能够达到令人满意疗效的药物较少。中药不仅有着来源广泛、种类及数量众多、毒副反应小的特点，而且有多环节、多层次、多靶点综合作用的特点，在治疗肝病方面有着独特的优势。从传统的中药中寻找有效部位或有效成分治疗病毒性肝炎已成为研究的热点［16］。本实验从肝康复合剂的三氯甲烷部位中分离得到15个化合物，据文献报道，桦木酸具有抗肿瘤作用和保肝作用［17］，乌苏酸具有抗炎保肝作用［18］，大黄素具有抗病毒作用和保肝作用［19］，云杉新苷具有降血脂作用和退黄保肝作用［20］，据此推测这几个化合物是该复方的活性成分，也初步验证本课题的合理性。但对于肝康复合剂中起退黄保肝作用的有效成分具体是什么，其药理作用机制如何，将有待于进一步深入研究。

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