生物技术在栝楼种质资源研究中的应用概况

王真真， 郭新苗， 辛 杰， 张荣超， 郭庆梅， 周凤琴

(山东中医药大学，山东济南250355)

来源于栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim．的传统中药包括全瓜蒌 (果实)、瓜蒌子 (种子)和天花粉 (根)，临床用于治疗多种疾病［1］。随着栝楼综合开发应用的领域拓宽［2-6］，栝楼新产区和种植面积不断增加，对栝楼种质优良性的要求日趋增高［7］。为了获得优良的中药种质资源，目前各种生物技术已被广泛地应用于中药的种质资源研究，包括分子标记技术［8-10］、生化标记技术［11-12］、细胞学标记技术［13-15］、种苗快繁技术［16-17］等。由于栝楼为雌雄异株、异花授粉植物，有的产区采用葫芦、丝瓜、南瓜等授粉，使栝楼的种质发生了许多变异，各地瓜蒌生产中存在着种质混乱、种苗良莠不齐的现象，栝楼种质资源的评价以及优良品种的筛选依然是一个困扰瓜蒌优质高产的严重问题。本文仅就生物技术在栝楼种质资源研究中的应用进行综述，为栝楼种质资源研究、优良种质筛选以及优良种苗繁育等提供资料。

1 分子标记技术

分子标记技术在栝楼种质研究中的应用处于起步阶段，主要集中在随机扩增多态性DNA标记 (RAPD)、锚定简单序列重复区间 (ISSR)、扩增片段长度多态性 (AFLP)等技术的应用。

1.1 RAPD技术在栝楼种质研究中的应用 黄璐琦等［18-19］用RAPD标记法对山东长清瓜蒌农家品种苗期进行了研究，使用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取DNA，扩增结果显示，该方法能明显区别瓜蒌的3个主流农家品种;在用该技术对天花粉及类似品进行鉴别的研究中，有效地将26个样品分成了三大类。王敏等［20］通过对山东仁瓜蒌、糖瓜蒌、牛心瓜蒌进行RAPD标记分析，发现牛心瓜蒌与仁瓜蒌的遗传距离 (0.478 261)最小，牛心瓜蒌与糖瓜蒌的遗传距离 (0.846 154)最大，这与生产实践中瓜蒌质量的表现一致。孙稚颖等［21］采用RAPD标记技术，对瓜蒌各农家品种、野生瓜蒌和山东误引种的湖北栝楼的亲缘关系进行了分析。结果显示，仁瓜蒌与牛心瓜蒌、小光蛋与野生瓜蒌、大瓜蒌与牛心瓜蒌亲缘关系较近，而明皮是形似小光蛋的一个独立农家栽培品种，地瓜蒌属于小光蛋的一个较初级的栽培品种，湖北栝楼与其它各农家品种差异显著。刘亚鲁等［22］对马山同一种植基地的7个性状特征不同的瓜蒌样品进行了RAPD分析，结果显示，7个瓜蒌样品的遗传物质之间存在差异，说明在生产实践中作为同一种种植的瓜蒌仍可能存在瓜蒌种质混乱的危险。曲益涛等［23］应用RAPD和序列特异性扩增区域 (SCAR)分子标记技术成功鉴别未成熟栝楼的性别，以指导生产上合理的雌、雄性植株田间配置以及育种工作［24］。以上实验说明，栝楼不同品种及品系之间的DNA进化速度、变异范围和遗传距离可以通过RAPD标记进行分析，并且取得了与形态学和生产实践比较一致的结果。

1.2 ISSR技术在栝楼种质研究中的应用 ISSR标记技术能较好的反映物种遗传结构和遗传多样性变化等，扩增特异性、稳定性、重复性较好。曲超等［25］通过单因素试验和正交试验，首次建立了栝楼ISSR-PCR分析的最适反应体系:20μL的反应体系中，1×buffer，模板量为50 ng，引物的浓度为0.5μmol/L，Taq DNA聚合酶的用量为0.8 U，dNTPs(三磷酸脱氧核糖核苷)的浓度为200μmol/L。李慧慧等［26］运用正交试验进行了更细致的体系优化，结果表明，20μL的反应体系中，DNA模板量为30 ng，MgCl2浓度为2.0 mmol/L，dNTPs浓度为0.3 mmol/L，引物浓度为0.5μmol/L，0.5 U Taq DNA聚合酶;退火温度为52℃ ～55℃;扩增反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s，52℃退火1 min，72℃延伸2 min，35个循环;72℃延伸7 min;4℃保存。高燕会等［27］基于ISSR分子标记法，对采自不同种植地区的34份栝楼种质进行了多态性和聚类分析。通过15条引物进行PCR扩增，共显示112条带，其中101条具有多态性，占总扩增带数的90%。结果显示，有效的将34份栝楼种质分为3大类群3小组。

1.3 AFLP技术在栝楼种质研究中的应用 千春录［28］用AFLP分子标记对12份栝楼材料进行实验，结果显示二倍体材料 (1、2、3号)为第1组，剩下的八倍体材料为第2组;组内差异分别由组内的明显分支显示。孙永刚［29］建立了可以用于栝楼雌雄株鉴别的AFLP反应体系，并筛选出了27对可用于栝楼AFLP分析的多态性引物。由于AFLP标记操作复杂、成本较高［30］，其应用受到局限。

2 生化标记技术

目前，同工酶标记和贮藏蛋白标记在栝楼种质研究中比较常用。

2.1 用于亲缘关系的判断 不同品种、产地栝楼的蛋白电泳图谱都会出现不同程度的差异［31］。孙稚颖等［32］采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，对山东栝楼农家栽培品种、野生种以及湖北栝楼的种子蛋白进行了分析。研究表明，山东优质农家品种仁瓜蒌、牛心瓜蒌的种子蛋白电泳谱图具有明显的相似性;小光蛋与野生栝楼的蛋白电泳谱图最相似;湖北栝楼与各山东品种在蛋白电泳图谱上有明显差异。这些结果结合性状特征从蛋白水平上说明:仁瓜蒌和牛心瓜蒌属于优质品种;小光蛋与野生品种较接近，品质稍差;湖北栝楼与栝楼是同科同属不同组别的物种。

2.2 用于栽培品种的鉴定 同工酶电泳图谱谱带发生多态性变化，反映了生物在蛋白质水平上的多型性，可作为生物遗传变异的证据［33］。孙稚颖等［34］以过氧化物酶同工酶及酯酶同工酶分析为手段，以山东栝楼的各农家栽培品种以及野生种的幼苗为实验材料，进行了同工酶电泳分析，结果表明，各农家栽培品种间及与野生种之间的酶带数量、带级、位点及活性强度等的差异可作为品种鉴定的依据;根据其同工酶谱图的相似程度判断，牛心瓜蒌与仁瓜蒌，野生栝楼与小光蛋，大瓜蒌、八棱瓜蒌及地瓜蒌彼此间亲缘关系较近，这与贮藏蛋白电泳图谱相结合可以更准确的判断各品种亲缘关系的远近。

2.3 用于雌雄性别的研究 栝楼种植时雌、雄比例对瓜蒌的产量起着关键性作用，在雌、雄植株区分方面生物技术优于传统的鉴别方法。于凤池等［35］对栝楼雌、雄不同器官进行过氧化物酶同工酶活性和电泳分析，成熟雌株叶片的过氧化物酶同工酶谱带比雄株多了第5条谱带 (Rf=0.643);在成熟器官 (叶片、卷须)中，雌株中的过氧化物酶同工酶活性比雄株强，但在幼嫩器官中两者差别不大。另有研究表明［29］，雌、雄株的叶片、叶柄、卷须、茎尖的各种同工酶图谱均存在不同程度差异。过氧化物酶同工酶图谱分析:叶柄的图谱中出现了4条相关谱带;多酚氧化酶同工酶分析:幼苗叶柄、茎尖图谱中雄株各出现1条特征谱带，卷须、叶片、茎尖图谱中雌株各出现1条特征谱带。雌雄株的酯酶同工酶图谱、雌雄株不同部位的同工酶含量也表现出一定的差异性。

3 细胞学标记技术

细胞学标记技术主要是指染色体核型和带型分析，是细胞遗传学研究的基本方法。

3.1 用于物种的鉴定 根据传统的理念，栝楼染色体的核型对称性、随体大小和数目等方面的差异可以作为分析栝楼不同基因型材料的亲缘关系及种质鉴定的方法。黄璐琦等［36］对国内栝楼属的8个物种进行了形态学观察和鉴定，发现了中药瓜蒌和天花粉的染色体特点为表现为八倍体，二倍体一般不能入药或甚至有毒副作用;并且，多倍体与器官特化以及地理分布尚未发现有规律的联系。

3.2 用于染色体倍数与次生代谢物质相关性研究 杨福红等［37］研究了人工诱变不同倍性染色体栝楼的生长发育及果实糖、酸含有量变化，结果表明四倍体栝楼的长势、叶片中含叶绿素量、果实中含总糖和总酸的量明显优于二倍体;四倍体栝楼果实大小、质量、结实率和百粒重明显小于二倍体，差异极显著。黄秋波等［38］以五个不同产地的9种栝楼品系为实验材料研究了染色体倍性与物质积累之间的关系，9个品系中一类是染色体数目为2，n=6X=66的六倍体，另一类是染色体数目为2，n=8X=88的八倍体。八倍体栝楼在整个生长发育时期其叶片可溶性糖含量均高于六倍体，在盛花期时的差异达显著水平;二者叶片可溶性蛋白含有量无明显差异，总体来看，以盛花期为限，之前，六倍体栝楼叶片可溶性蛋白质含有量高于八倍体，之后，八倍体栝楼叶片中可溶性蛋白质含有量相对更高;八倍体栝楼叶片含叶绿素量都低于六倍体，不同发育时期的相对差异幅度为4%～10%。这为栝楼优良品种的培育和多倍体育种提供了指导依据。

4 种苗快繁技术

4.1 外植体选择研究 在已有的关于栝楼试管苗快速繁殖体系［39］和外植体取材研究［40］的基础上，杨晓伶等［41］以栝楼茎段、叶片、块茎幼苗的茎尖和带芽茎段进行了快繁外植体选择研究。结果表明，MS培养基+2 mg/L苄氨基腺嘌呤 (BA)+0.5～0.05 mg/Lα-萘乙酸 (NAA)可诱导块茎幼苗茎尖及带芽茎段产生丛生芽，在MS培养基+0.1 mg/L NAA+0.2 mg/L吲哚丁酸 (BA)作用下生根，能够在移栽后实现快速繁殖，而茎段和叶片可形成愈伤组织，但不能形成根。

4.2 最佳快繁条件研究 余慧琳等［42］通过对茎段腋芽的离体快繁研究，确定了形成无菌试管苗的最佳培养基为MS培养基+0.2～0.3 mg/L BA+0.1～0.2 mg/L NAA组合;继代增殖最佳培养基为MS培养基+0.1 mg/L BA+0.1～0.2 mg/L NAA组合;生根最佳培养基为1/2 MS培养基+0.2 mg/L NAA组合。陈惠［43］研究发现将不定根根尖，接种在MS+4 mg/L BA的培养基上光下培养效果最佳。兰伟等［44］研究并确定了适宜栝楼芽及愈伤组织诱导、繁殖、生根的最佳培养基条件。有研究［45］对不同激素对栝楼试管苗生根影响进行了研究，6-苄氨基腺嘌呤 (6-BA)为1.5 mg时对芽的诱导效果最好;采用MS培养基附加1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA+0.05 mg/L NAA增殖效果好;IBA比NAA更能促进生根。各种最佳条件的确立对于栝楼优质种苗选育、大规模细胞培养以提取有效成分的研究有着重要意义。

4.3 其它 近年对栝楼细胞培养、雌雄株组织培养和发根农杆菌诱导的研究也有报道［46］，建立起了分散程度较好的栝楼悬浮细胞系，发现了雌雄栝楼愈伤组织的分化具有性别差异，培养基也有所不同。宁志怨［47］、丁婷等［48］分别对发根农杆菌诱导栝楼组培苗茎段和叶片生根、无菌苗毛状根发生进行了实验，发现该种方法可以成功地整合基因，后者发现LBA9402农杆菌对毛状根的产生诱导率最高，并且毛状根不定芽最佳分化培养基为 (6-苄基氨基嘌呤)2.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L激动素+0.5 mg/L NAA。

5 小结与展望

5.1 分子标记技术 由于分子标记技术在栝楼种质资源研究中的应用缺乏任何分子生物学的研究背景，在研究过程中，要得到具有统计意义的结果，必须选择多达几十条，甚至上百条随机引物。实验过程中，PCR这一步骤受到退火温度等诸多因素的影响，所以各种分子标记技术的稳定性和可重复性尚有待深入研究。另外，ISSR标记在栝楼种质研究中的应用研究不够深入，并且各种技术之间缺乏一定的相互印证。但不可否认，分子标记技术在目前栝楼DNA序列尚未清楚的情况下，有着广阔的应用前景;随着该技术与经典形态学相结合在栝楼种质研究中的深入应用，可以考虑从碱基水平上进行研究，探索DNA序列差异与有效物质之间的关系，不仅使种质差异更加具体化，而且可以更加具体的指导良种选育和大规模细胞培养。

5.2 生化标记技术 生化标记技术用于不同品种栝楼的区分，但产地、生长年限、部位和性别的不同都会使谱图产生差异。今后在种质区分研究中可以考虑同时运用多种技术，相互印证，获得更为稳定的结果;而在栝楼遗传结构和遗传多样性变化的研究中就要考虑到产地、年限、部位、性别的因素，适时应用。比如，Lata等［49］已将ISSR技术用于微体繁殖植株的遗传稳定性研究，可以将该技术用于栝楼优良种质快繁植株的基因稳定性研究，以确保种质研究的有效性。

5.3 细胞学标记技术 目前已将栝楼染色体核型分析应用于物种进化分析［15］和染色体核型与果实中糖酸积累、植株生长发育相共性的研究，对优良品种的选育发挥了重要作用。染色体作为遗传物质的载体，具有指导合成生物体内各种蛋白质、核酸等的遗传信息，因此，与生物体内次生代谢产物的形成和积累有着必然的联系。细胞学标记技术与次生代谢产物相关性的研究，对于栝楼优良种质选育和大规模规范化种植及细胞培养有着重要的指导意义。所以，对于栝楼有效物质的积累与遗传物质的关系的研究将会越来越受到大家的重视。

5.4 种苗快繁技术 栝楼是雌、雄异株植物，种子繁殖极易发生变异，且雌雄难辨;用分根法繁殖系数低，使发展良种生产受到一定限制。利用组织培养法进行种苗快繁，具有繁殖系数高、速度快、成苗率高等优点，可作为栝楼良种快速繁殖的有效途径。人们已经对外植体、最佳培养基、激素、细胞培养、发根农杆菌诱导毛状根发生等方面进行了研究，建立了多个快繁体系。为了理顺栝楼优质种苗渠道，尚需将快繁技术规范化和规模化，才能使现代生物技术应用于生产实践中。

5.5 展望 栝楼种质资源研究中尚普遍存在着样品的有限性问题，需要全面收集全国的栝楼种质;针对栝楼种质丰富、良莠不齐的现状，可以先通过分子标记技术 (主要是ISSR标记技术)进行遗传结构和亲缘关系的研究，进而结合生化标记技术和经典形态学研究进行细致的品种划分。在此基础上，再进行有效物质和快速繁殖的研究。运用生物技术对栝楼进行种质研究，顺应了从分子水平上对中药材进行质量控制的趋势，将对栝楼的质量控制、活性成分研究产生不可估量的作用。

［1］国家药典委员会．中华人民共和国药典:2010年版一部［S］．北京:中国医药科技出版社，2010．

［2］陈 勤．中药美容保健品的研究与开发［M］．北京:中国医药科技出版社，1999:21．

［3］王 曼，史素霞．具有开发价值的观果植物栝楼［J］．北方园艺，2007，31(12):166．

［4］任 静，何家庆．栝楼子资源的利用及其价值［J］．中国野生植物资源，2001，20(6):21-22．

［5］高家春．垂直绿化新秀——栝楼［J］．园林科技，2007，(1):21．

［6］胡玉涛，王 沫，肖平阔．应用栝楼进行郊区绿化的探讨［J］．中国林副特产，2006，(5):81-83．

［7］张龙霏，李 佳，郝 志，等．栝楼种质资源与良种选育研究概况［J］．中国现代中药，2010，12(8):10．

［8］战晴晴，隋 春，魏建和，等．利用ISSR和SSR分子标记构建北柴胡遗传图谱［J］．药学学报，2010，45(4):517-523．

［9］许永华，张爱华，金 慧，等．人参种源遗传关系的ISSR分析［J］．中草药，2010，41(7):1164-1167．

［10］张忠廉，李学兰，杨春勇，等．砂仁遗传多样性的ISSR分析［J］．中草药，2011，42(3):570-574．

［11］谢果珍，舒少华，王 沫．栝楼不同居群可溶性蛋白质和酯酶同工酶电泳分析［J］．湖北农业科学，2009，48(2):385-387．

［12］于 晶，陈 君，徐 荣，等．不同种源黄芩的过氧化物同工酶研究［J］．中药材，2006，29(7):647-649．

［13］陈 黎，吴 卫，郑有良．不同染色体数目鱼腥草挥发油成分的薄层色谱分析［J］．中草药，2004，35(12):1399-1402．

［14］余丽莹，谭小明，周雅琴．两面针染色体的核型分析［J］．时珍国医国药，2010，21(12):3284-3285．

［15］王 岚，刘丽莎，吴 迪，等．麻花秦艽染色体的核型分析［J］．中药材，2010，33(2):171-173．

［16］李铁军，冯建忠，黄丽华，等．泰山四叶参的组织培养与快速繁殖［J］．中药材，2011，34(11):1667-1671．

［17］刘晓东，单丽辉，李玉珠，等．多叶棘豆组织培养及快速繁殖研究［J］．中药材，2011，34(11):1661-1663．

［18］黄璐琦，王 敏，杨 滨．瓜蒌农家品种苗期的分子标识鉴别［J］．中国中药杂志，1999，39(9):642．

［19］黄璐琦，王 敏，杨 滨，等．用随机扩增多态DNA(RAPD)技术鉴别中药材天花粉及其类似品［J］．药物分析杂志，1999，19(4):233-237．

［20］王 敏，黄璐琦，付桂芳．栝楼3个农家品种间亲缘近似关系的RAPD分析［J］．中国中药杂志，1999，24(6):336-337．

［21］孙稚颖，周凤琴．山东产瓜蒌不同农家品种的RAPD研究［J］．中草药，2006，37(3):26-429．

［22］刘亚鲁，李 峰，宋艳梅，等．山东道地药材瓜蒌7个样品的RAPD 分析［J］．山东中医杂志，2012，31(3):206．

［23］曲益涛，董 玲，江 芹，等．栝楼的RAPD-PCR体系建立与优化［J］．安徽农业科学，2010，38(13):7150-7152．

［24］曲益涛．栝楼性别转化的RAPD-SCAR标记研究［D］．合肥:安徽农业大学，2010．

［25］曲 超，孙 群，丁自勉，等．栝楼ISSR-PCR反应体系的建立和优化［J］．基因组学与应用生物学，2009，28(1):127-131．

［26］李慧慧，朱玉球，斯金平，等．栝楼ISSR-PCR体系的正交优化［J］．生物技术，2009，19(6):38-41．

［27］高燕会，李慧慧，朱玉球，等．给予ISSR的栝楼遗传多样性分析［J］．中草药，2011，42(2):363-366．

［28］千春录．药用植物栝楼种质资源及多样性研究［D］．杭州:浙江大学，2007．

［29］孙永刚．栝楼苗期雌雄株鉴别的研究［D］．合肥:安徽大学，2007．

［30］李 婷，林文津，徐榕青，等．ISSR技术在药用植物种质研究中的应用［J］．中国民族民间医药(药物研究)，2010，(1)，41-42．

［31］董婷霞，徐国钧，金蓉鸾，等．栝楼属种子类药材的蛋白电泳鉴别［J］．中国药科大学学报，1990，21(4):249-250．

［32］孙稚颖，周凤琴，郭庆梅．山东产不同农家品种瓜蒌的种子蛋白电泳分析［J］．时珍国医国药，2005，16(12):1224-1225．

［33］段会军，张彩英，张丽娟，等．河北省大豆种质资源同工酶及RAPD标记多样性研究［J］．中国油料作物学报，2003，25(2):15-20．

［34］孙稚颖，李恩波，周凤琴．山东农家栽培瓜蒌品种的同工酶研究［J］．中草药，2005，28(10):863-865．

［35］于凤池，孙耘子，袁高峰，等．栝楼性别分化特异大分子标记物研究［J］．浙江农业学报，2003，15(6):332-335．

［36］黄璐琦，乐崇熙．栝楼属8种植物的染色体数目［J］．云南植物研究，1994，16(1):95-96．

［37］杨福红，吴玉香，赵晓明．不同倍性栝楼生长发育及果实糖酸含量的研究［J］．中国农学通报，2008，24(12):220-224．

［38］黄秋波．不同品系栝楼的生理基础研究［D］．武汉:华中农业大学，2009．

［39］佟宏霞，李喜文，邢 苗．栝楼组织培养和植株再生研究［J］．中国中药杂志，1996，21(12):721-722．

［40］陈 惠，梁倩华．栝楼组织培养中植株再生的研究［J］．中草药，1996，27(12):737-740．

［41］杨晓伶，金关荣，杨瑞鹏，等．栝楼的组培快繁技术研究［J］．中药材，2006，29(11):1129-1130．

［42］余慧琳，胡月华，李 君．栝楼离体快繁的初步研究［J］．湖北农业科学，2009，48(2):272-274．

［43］陈 惠．栝楼的根段及根尖培养与器官发生［J］．山西师范大学学报:自然科学版，1994，8(1):52-57．

［44］兰 伟，蔡 健，朱茂英，等．栝楼的组织培养与快速繁殖［J］．植物资源与环境学报，2006，15(4):73-74．

［45］廖华俊，董 玲，江 芹，等．栝楼组织培养及非试管苗快繁技术研究［J］．中国瓜菜，2006(3):4-7．

［46］朱苏文，马 庆，汪 馨，等．栝楼细胞悬浮系的建立［J］．安徽农业科学，2007，35(16):4814-4815．

［47］宁志怨，董 玲，陈静娴，等．发根农杆菌对栝楼的遗传转化［J］．安徽农业科学，2007，35(14):4142-4143．

［48］丁 婷，马 庆，项 艳．发根农杆菌诱导栝楼毛状根的研究［J］．安徽农业大学学报，2008，35(3):436-439．

［49］Lata H，Chandra S，Techen N，et al．Assessment of the genetic stability of micropropagated plants of Cannabis sativa by ISSR markers［J］．Planta Med，2010，76(1):97-100．