自身免疫病与表观遗传学①

张 璐 焦 敏 邹红云

(新疆石河子大学医学院免疫教研室，石河子832000)

自身免疫病是一种多因素参与的复杂疾病。遗传背景只能决定个体对疾病的遗传倾向或者易感性，但并不是疾病发生的最终因素。以往研究发现，有些被证明具有遗传性的疾病并不能完全用精确的遗传学观点解释，这就说明基因组中除了DNA和RNA之外，基因的表达还受到其他因素的调控。表观遗传学概念的提出，为自身免疫病的研究开拓了新的领域。表观遗传学是在不改变基因序列的前提下，通过DNA和组蛋白化学修饰、RNA干扰、染色质重塑等多种机制而影响和调节基因的功能和特性，并能通过细胞分裂和增殖周期遗传给后代。表观遗传学对环境刺激非常敏感，这就提示我们是否可以从基因序列变异以外的因素来认识疾病的发生、发展。这可能为正确认识自身免疫病，癌症等重大疾病提供新的线索和思路。

1 表观遗传学机制

表观遗传学(Epigenetics)的概念于1942年由Waddington首先提出，它是研究基因型产生表型的过程，是与遗传学(Genetics)相对应的概念。遗传学研究以DNA排列序列为基础的遗传编码信息，而表观遗传学则研究那些决定遗传编码信息何时何地表达的表观调控信息。前者就如一个丰富多彩的信息库，而后者则是对信息库进行选择性使用的调控信息库。表观遗传学主要作用机制包括:

1.1 DNA甲基化 DNA甲基化是由DNA甲基转移酶(DNA methyl-transferaseDNMT)催化，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)作为甲基供体，将甲基基团合成到5'-CpG-3'中胞嘧啶的第五位碳原子上，DNMTs家族中DNMT1是DNA复制后负责维持DNA甲基化的酶，即甲基化DNA复制后形成的半甲基化的DNA在DNMT1的作用下根据亲链上的甲基化位点进行相应的甲基化修饰的过程。DNMT3A和DNMT3B主要负责重新甲基化作用，重新甲基化是指在原来没有甲基化的DNA双链上进行甲基化的过程。

在哺乳动物基因组中，DNA甲基化主要发生在CpG岛，CpG岛是长度不小于500 bp，CG含量不小于55%的一段区域。据统计，50%以上的基因的启动子区含有CpG岛，故 CpG岛具有重要的调控功能。

大量研究表明DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，使基因沉默，从而控制基因表达。其在胚胎发育、X染色体失活、DNA结构调整、调节基因的表达及DNA与蛋白质之间的相互关系、基因组标记等方面起重要作用。由此可见，染色质DNA的甲基化是表观遗传信息的主要形式，可存在巨大的DNA甲基化可能的组合贮存大量的信息。

1.2 组蛋白修饰 组蛋白是真核生物的基本结构蛋白，是核小体的重要组成部分。它是一类含正电荷的碱性蛋白质，能与DNA中带负电荷的磷酸集团相互作用。组蛋白包括H1、H2A、H2B、H3、H4五种类型，根据其功能的不同将其分为2组:(1)包括H2A、H2B、H3、H4构成核小体的核心蛋白，其相对分子质量较小，进化十分保守，无种属及组织特异性。(2)H1组蛋白，起到连接核小体的作用，有一定组织种属特异性，进化上也没有其他组蛋白那么保守。除H1组蛋白外，其他都是N端富含碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸)，C端富含疏水氨基酸 (如缬氨酸、异亮氨酸)。组蛋白C端带有折叠基序(motif)，与DNA的缠绕有关，富含赖氨酸的N端，其尾部的15～38个氨基酸残基是组蛋白修饰的主要位点，能调节DNA的生物学功能。

研究表明，只有改变组蛋白的修饰状态，使DNA和组蛋白的结合变松，才能使相关基因表达，因此组蛋白修饰与染色体的结构和功能密切相关。其修饰种类主要包括组蛋白的甲基化、乙酰化、磷酸化、糖基化和泛素化等，都是由特异性的酶催化完成的。例如:组蛋白乙酰化转移酶(HATS)可增加几种转录因子的活力，通过诱导组蛋白乙酰化使得启动子可以接近转录调控机制。相反的是，去乙酰化酶(HDACs)降低组蛋白的乙酰化水平，同转录抑制相关。组蛋白甲基化状态与细胞分化密切相关，研究证明，对应IFN-γ基因位置的组蛋白3第9位赖氨酸(H3K9)和组蛋白3第27位赖氨酸(H3K27)甲基化模式决定了native T向Th1分化还是向Th2分化，Th1细胞持续性地维持着H3K9甲基化状态，而Th2细胞H3K9去甲基化，但维持H3K27甲基化状态，这种组蛋白最终的一个甲基化状态是特定谱系细胞的一个标志［26］，而T细胞分化又与自身免疫性疾病密切相关。单一组蛋白的修饰往往不能独立地发挥作用，一个或多个组蛋白尾部的不同共价修饰依次发挥作用或组合在一起，形成一个修饰的级联，它们通过协同或拮抗来共同发挥作用。有人将组蛋白的这种修饰称为“组蛋白密码”。

1.3 染色质重塑 在基因表达复制和重组过程中，对应基因尤其是基因的调控区的染色质的包装状态，核小体和组蛋白以及对应的DNA分子会发生一系列的改变，这就是染色质重塑，与组蛋白修饰密切相关。在细胞核中，DNA链缠绕在组蛋白的表面，然后再进一步卷曲盘绕形成致密包装的结构，即成为染色质。而通过组蛋白N端末尾的修饰直接影响核小体的结构，并为其他蛋白质提供了和DNA作用的结合位点。染色体重塑主要是依赖和利用ATP水解释放的能量，使DNA超螺旋旋矩和旋相发生变化，使转录因子更易接近并结合核小体DNA，从而调控基因的转录过程。

1.4 非编码RNA的调控 miRNA是一组翻译后调控装置，在生物体的增殖、分化、凋亡等过程中均有其参与［1］。miRNA是一种非编码RNA，长度大约在22 nt，非编码RNA通过互补结合到不同种类的mRNA上，致使目标mRNA降解，影响 mRNA翻译和基因的转录，从而产生表观遗传效应［2］。与正常编码蛋白质的RNA类似，miRNA是由基因组编码，并由RNA聚合酶2催化生成。我们现今知道的miRNA影响DNA表达的最典型例子就要数女性X染色体的失活了。事实上，雌性生物体中的一条X染色体是通过表观遗传学的机制失活的，从而使X染色体的产物达到剂量补偿［3］。有研究表明Xist(X-inactive-specific transcript)基因的转录是导致X染色体失活的重要因素，Xist产生一个17 kb的非编码的RNA分子将小于150 MB的X染色体包裹起来，从而影响X染色体的转录和翻译，最终导致基因沉默［4］。现今，许多研究者认为某些疾病的发病机制可能与X染色体失活异常有关，这种假说已经被越来越多的研究者认可。它似乎更能合理的解释自身免疫性疾病女性高发这一临床现象［5］。

近来研究证实，miRNA与T细胞的增殖分化密切相关。T细胞在静止、效应和记忆三个阶段中，miR-16、miR-21、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-150、miR-15b和let-7这7种miR的表达量占总T细胞miR表达总量的60%以上，并且它们的表达水平呈阶段性变化［27］。miR对T细胞的调控有类似细胞因子的特点即形成一个调控网络，之间的miR既有协同作用，也存在拮抗。

2 自身免疫性疾病与表观遗传学

在所有复杂疾病的研究中，表观遗传学的影响日益受到国内外研究者的重视。随着研究的深入，它的重要作用将在未来的医学研究中更加凸显。在自身免疫病中发现，免疫细胞表观遗传学调节的失误将破坏自身的免疫耐受。对人类和动物的单个核细胞的研究均显示，某些表观遗传修饰的改变可以引起自身免疫系统功能的紊乱。

2.1 系统性红斑狼疮 系统性红斑狼疮(SLE)是一种以大量的自身抗体产生并引起多系统损伤为主要特征的自身免疫性疾病，具体发病机制不明。以往的研究认为基因异常是造成SLE的主要因素，但是SLE的发病在同卵双胞胎中却没有显现出应有的高度一致性，这一现象提示我们，在疾病的发生发展中可能还存在其他重要的调控机制。其中表观遗传机制就是其他众多因素之一，在动物实验和人类研究中均发现T或B淋巴细胞DNA甲基化修饰异常在诱发SLE方面有重要作用［6］。

DNA低甲基化可以影响T细胞染色体结构，从而导致T细胞过度活化［7］。DNA甲基转移酶受细胞外信号调节激酶(ERK)途径调控［8］，在动物实验中显示，这一通路缺陷会导致小鼠T细胞中DNMT1的下降，从而使甲基化敏感的免疫基因过度表达。这种由于ERK信号缺陷导致DNA甲基化转移酶的表达下降从而调节DNA甲基化的方式和改变基因的表达来参与自身免疫病的发展的机制，可能参与特发性和药物诱导狼疮的发病。

寡核苷酸序列分析已经证实，在体外用DNA甲基转移酶抑制剂5-聚胞苷处理人T淋巴细胞后，有100多种已知基因的转录增加，其中包括一些狼疮相关基因如:淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1;CD11a/CD18)、穿孔素、CD70、IgE FcR γ1 、CD40L、IFN-γ基因等［9］，这与SLE患者所产生的临床表现一致。DNA低甲基化通过促进共刺激分子的表达使T细胞具有自身反应性，一方面活化的T细胞能促进B细胞分泌免疫球蛋白，另一方面还能杀伤巨噬细胞，增加血液中的自身抗体，降低了对免疫复合物的清除，两者相互促进，从而产生了大量的自身抗体。

近期的研究发现女性易患狼疮的原因与DNA甲基化状态相关，女性SLE患者其一条失活的X染色体的调节序列发生DNA低甲基化使CD40过度表达，而男性SLE患者则不过度表达CD40［10］。

以往的研究表明，在SLE活动期患者的T细胞内，脱氧甲基胞嘧啶存在总体含量的降低并伴有DNMT1转录水平的下降。有研究证明人类内源性逆转录病毒(Human endogenous retroviruses，HERV)是引起许多自身免疫疾病的一个原因［11］。SLE患者甲基化转移酶表达减少导致了低甲基化，从而增加了HERV基因的转录，而HERV的表达可能促进针对凋亡核碎片的抗DNA抗体的产生，从而参与了疾病的发生和进展。

以上这些临床现象均与DNA异常甲基化相关。

组蛋白修饰的研究已在狼疮鼠模型与狼疮病人中展开。在活动期SLE患者CD4+T细胞中存在H3和H4的总体乙酰化水平降低，且H3的乙酰化水平与疾病活动呈负相关［12］。体外实验证实，去乙酰化酶抑制剂能够增强H3和H4的乙酰化作用，并降低IL-12、IFN-γ、IL-6和 IL-10的表达。乙酰转移酶突变的小鼠表现出严重的狼疮样病变，例如:大量的抗ds-DNA自身抗体，肾小球肾炎和早产死胎等［13］。

2.2 类风湿性关节炎 类风湿性关节炎(RA)是一种以周围关节慢性系统性炎症为主要表现的自身免疫性疾病。与SLE类似，RA也是遗传因素、免疫系统失调和环境影响等综合因素共同作用的结果。研究表明，RA患者关节滑液中成纤维细胞在疾病的发生和持续中扮演重要角色。RA患者外周血单核细胞中IL-6启动子区域内的未甲基化CpG岛与局部炎症反应通路过度活化有关。研究还发现，在RA患者关节滑液的单核细胞中存在DR-3启动子区内CpG岛的甲基化修饰的改变，这种改变能导致细胞凋亡受阻［15］。

在类风湿关节炎小鼠模型中观察到，FK228能有效抑制关节炎小鼠的关节肿胀、滑膜炎症和继发性骨和软骨破坏。FK228能诱导滑膜细胞的组蛋白的过度乙酰化，并降低关节炎小鼠滑膜组织TNF-α的水平。在体外实验中FK228能抑制关节炎滑膜成纤维细胞的增殖，该作用呈浓度依赖性。VEGF在类风湿性关节炎血管形成过程中具有重要作用，给关节炎模型小鼠静脉注射FK228可有效地抑制滑膜组织VEGF的表达并改善关节炎症状。这些结果显示由FK228介导的染色质结构重塑在抑制由缺氧调控基因调控滑膜血管生成过程中发挥了有益的作用。

研究还发现，miRNA-155与miRNA-146在RA患者中异常表达，可能与RA发病相关。在RA患者关节滑液的成纤维细胞中存在miRNA-155与miRNA-146的高表达，但在单纯的骨关节炎患者中却无此现象［16，17］。

2.3 Ⅰ型糖尿病 Ⅰ型糖尿病是一种T细胞介导的自身免疫性疾病，并具有遗传易感性。在过去的10年中，该病的发病率明显上升。对其发病机制的研究，大多集中在饮食与易感基因的关系上，但研究成果却十分有限。表观遗传学认为，原始的胰腺损伤触发了自身免疫攻击，导致细胞修复机制的活化，最终影响表观遗传修饰的完整性。另外，表观遗传修饰还能调控淋巴细胞的成熟与细胞因子的表达，例如:Th细胞分化这一复杂的免疫学过程就是由表观遗传修饰调控的，还能调节胰岛细胞的修复过程。DNA中CpG二核苷酸的甲基化模式和组蛋白修饰的形成和维护都依赖于细胞内甲基集团的代谢过程，这一过程需要多种营养物质参与，比如叶酸，叶酸和高半胱氨酸与甲基化状态呈现反向相关。叶酸会将半胱氨酸转化成甲硫氨酸，而甲硫氨酸会变成通用的甲基化供体，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。SAM负责甲基化几个生物底物，其中就包括DNA的甲基化［18］。在对动物模型和人类的研究中都发现，在胚胎发育期，宫内和围产期饮食与表观遗传修饰之间具有十分密切的关系［19］，比如低蛋白饮食会降低胰岛细胞数量和影响其血管的形成从而对后代的胰腺发育造成影响，这种由营养物造成的甲基化供体缺乏将对DNA甲基化产生不可逆的影响。因此，营养情况和不同的环境因素被证明影响人类基因组的表观遗传修饰，最后导致代谢紊乱和慢性疾病的发生。

Gray等经过研究认为，糖尿病状态下，组蛋白乙酰化与炎症相关。HATs和HDAC可调节与糖尿病发病相关的几个重要基因表达［20］。NF-κB是一个调节炎症性疾病基因表达的转录因子，HATs和HDAC通过调节NF-κB的转录活性，致使环氧化酶2(Cyclooxygenase-2，COX-2)和肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)炎症基因表达增加。这种调节体外实验也证明，糖尿病患者单核细胞内上述炎症因子基因启动子组蛋白乙酰化增加。

miRNAs在糖尿病肾病发生发展中也具有一定的作用。TGF-β信号调节与糖尿病肾病发病密切相关用 TGF-β处理肾小球系膜后会导致 miR-192、miR-216a、miR-217和miR-377表达升高，促进胶原和纤维连接蛋白表达增加［21］。

2.4 其他自身免疫病 史蒂文斯-约翰逊综合征(SjS)是累及唾液腺和泪腺导致口眼干燥的一种自身免疫性疾病，其病因尚不明确。最近的研究显示，miRNA-547-3p与miRNA-768-3p在SjS病人的唾液腺中过度表达［22］。在 SjS的动物模型中，miRNA-150和miRNA-146在靶器官和外周血淋巴细胞中都过度表达。miRNA-146现已被证实在SjS患者靶器官和外周血淋巴细胞中同样存在过度表达［23］。这就提示我们miRNA可能在疾病的发生发展中扮演重要角色。

系统性硬化症(Systemic sclerosis，SSc)是以进行性血管病变为主，局限性或弥漫性皮肤纤维化并累及其他器官的一种自身免疫性疾病，发病机制不详。一般认为与间质成纤维细胞过度活化有关，转化生长因子β(TGF-β)可以减少金属蛋白激酶1和金属蛋白激酶3前体的合成，从而使胶原蛋白降解减少，最终导致纤维化。有研究发现，SSc患者成纤维细胞胶原合成增加与胶原抑制基因FLI1表达失控有关，FLI1启动子区CpG岛大量的甲基化在SSc患者成纤维细胞和皮肤活检标本中被证实［24］。我们已经知道DNA甲基化与维系女性失活的X染色体的静默状态有关，而Ozbalkan等［25］对女性SSc患者失活的X染色体研究发现，失活的X染色体出现偏斜，而同时这也许是女性SSc发病率高的原因之一。

2.5 表观遗传学在自身免疫病中的临床意义 表观遗传学在自身免疫病的发生发展中的重要作用正日益受到各国研究者的重视，这就启发我们是否可以开发出新的药物以纠正自身免疫病患者的异常表观遗传修饰，从而达到对疾病治疗的目的。关于这类药物的研究已经在动物模型中展开，比如组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A(Trichostatin A，TSA)和羟肟酸类(Suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)可有效改善狼疮鼠的肾小球肾炎和单纯脾肿大。通过调控特定的miR，可以辅助治疗与T细胞分化相关的自身免疫性疾病和肿瘤;如在肿瘤发生时可考虑适当增高T细胞中miR的表达水平，促进T细胞向Th1方向分化，增强体内抗肿瘤应答和IL-2和IFN-γ的分泌。miR及其靶基因在未来很可能成为免疫疾病诊断的新型标志物和治疗的有力工具［28］。

3 展望与结语

大量研究已经证实表观遗传修饰在自身免疫病发生发展中的重要作用。在过去的几年里，随着表观遗传学理论的不断充实，特别是一系列环境表观遗传学理论的形成，绘制全基因组DNA甲基化谱和破译组蛋白密码已成为现代遗传学家的当务之急。任何细胞无时无刻不受到表观遗传修饰的调控，肿瘤细胞和免疫细胞也不例外。我们相信，对这些调控机制的深刻理解和靶向分子的鉴定将对认识生命活动的基本规律以及探讨疾病发生发展机制和防治措施都具有重大意义。运用其理论可以指导疾病的治疗和研发新的治疗药物，这无疑将是一项极具应用前景的研究。

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