TLR4与抗磷脂综合征血栓形成研究进展①

解鸿翔 周 红

(江苏大学基础医学与医学技术学院，镇江212013)

抗磷脂综合征 (Antiphospholipid syndrome，APS)为一种非器官特异性自身免疫性疾病，主要临床表现为复发性动静脉血栓、习惯性流产和血小板减少等［1］，其中血栓形成是APS的主要病理基础和最突出临床表现，也是造成患者死亡的重要原因。前瞻性研究表明，虽然经过反复的抗凝治疗，但APS患者仍然有显著的发病率和死亡率［2］。本文对TLR4及其介导的信号通路在APS血栓形成中作用做一综述，以期对APS病理机制有更好的理解，为APS治疗提供新的方法。

1 TLR4及其介导的信号途径

Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)是与微生物识别有关的天然免疫受体家族，属模式识别受体，分布广泛。TLR不仅通过选择性地识别病原体中病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)的保守结构，实现对入侵病原体的早期识别，激活天然免疫，还可提供刺激分子和诱导T细胞分化的细胞因子，帮助机体建立获得性免疫［3］。至今在人类已发现 11种 TLRs(TLR1～TLR11)，TLR4是第一个被认识的人类Toll样受体蛋白。

TLR4属于Ⅰ型跨膜蛋白，由细胞外区、跨膜区和细胞内区三个部分组成。其胞外区结构有富含亮氨酸的重复序列，负责识别不同的配体;胞内区与IL-1受体的胞内区相似，负责受体活化后的信号转导，其中TIR区域是TLR4与其下游相关的信号转导分子相互作用的关键部位。

目前已知TLR4介导的信号转导包括MyD88依赖性和非依赖性途径。TLR4与配体结合后发生二聚化，在MD-2分子的参与下，结构发生改变并募集下游的信号蛋白MyD88。MyD88通过其羧基(C)端与TLR4的TIR区发生同源性相互作用，其氨基(N)端的死亡结构域又招募IRAK4、未磷酸化的IRAK1，使两者形成复合物，引起 IRAK1活化和 IRAK4自身磷酸化。随后此复合物从MyD88上解离，与具有E3泛素连接酶活性的TRAF6相互作用。TRAF6与泛素结合酶13(Ubiquitin-conjugating enzyme 13，Ubc13)、泛素结合酶 E2变体1亚型 A(Ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 1 isoform A，Uev1A)结合，促使63位赖氨酸连接的多聚泛素链的合成，导致TAK1的激活。TAK1与TAB1(TAK1-binding protein 1)、TAB2(TAK1-binding protein 2)形成复合体，经IκB激酶(IKK1-IKK2-IKKγ)磷酸化激活NF-κB或经p38、JNK等促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)途经活化激活蛋白-1(Activator protein，AP-1)，诱导细胞因子如 IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、干扰素(Interferon，IFN)和粘附分子等基因的表达［3，4］。TRIF 是TLR4激活后TIR结构域募集的另一接头蛋白，其介导的信号途径又称MyD88非依赖途径或TRIF依赖途径。TRIF分子通过250-255位氨基酸构成的T6BM结构域和661-699位氨基酸构成的RHIM结构域分别结合TRAF6和RIP1(Receptor-interacting protein 1)，后两者可独立介导 TRIF途径的NF-κB激活过程。TRIF与RIP1结合后还可以通过Fas相关死亡结构域(Fas associated death domain，FADD)，活化caspase信号转导途径，最终导致细胞凋亡的发生。此外，TRIF也可以与TBK-1及IKKε结合，后两者可作为IRF3的激酶使IRF3活化，诱导包括IFN-β在内的一系列基因的转录。

TLR4主要表达于单核巨噬细胞、粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞、内皮细胞，以骨髓单核细胞的表达为多。TLR4作为人类天然免疫的重要受体，可以识别多种配体，最主要的是来源于细菌的脂多糖(LPS)，此外还能识别呼吸道合胞病毒蛋白F、分枝杆菌成分、热休克蛋白、纤维结合蛋白、肝素、透明质酸酶、纤维蛋白原等。作为调节机体免疫功能的重要分子，在特定条件下，TLR4可异常高表达并过度激活，导致机体功能紊乱，引发各种疾病，包括自身免疫性疾病。

2 β2GPI与细胞表面受体

大量研究表明，APS患者血清中的高滴度的抗磷脂抗体(antiphospholipid antibody，aPL)与其病理机制密切相关。但aPL针对的靶抗原不是磷脂，而是一大类吸附于阴离子表面的磷脂结合蛋白，其中β2糖蛋白I(beta-2-glycoprotein I，β2GPI)是aPL的关键靶抗原。临床研究显示多数反复发生血栓的患者可检测到抗β2GPI抗体，经亲和纯化的APS患者来源的抗β2GPI抗体能诱导小鼠血栓形成［5，6］。抗β2GPI抗体可通过β2GPI依赖的方式激活血管内皮细胞，使其上调细胞粘附分子(E-selectin、ICAM-1、VCAM-1)的表达，分泌和释放促炎性因子(IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1、TNF-α)和组织因子(Tissue factor，TF)等，也可以刺激血液单核细胞分泌炎症因子和表达TF［7-10］。其中TF在APS血栓形成中扮演关键角色。TF为贯穿于细胞膜的单链糖蛋白，可以作为凝血因子Ⅶ/Ⅶa的受体，以TF/Ⅶa复合物的形式激活凝血因子Ⅸ、Ⅹ，从而引发血液凝固。

过去的研究表明，β2GPI不是简单的绑定细胞表面带负电荷的磷脂，而是通过特殊的受体结合到细胞表面。体内和体外研究表明膜联蛋白A2(Annexin A2)是β2GPI的高亲和力受体，将β2GPI连接在靶细胞上，介导aPL诱导的病理效应［11-13］。Annexin A2，内皮细胞表面组织型凝血酶原激活物的受体，是一种无跨膜区域的膜蛋白，不能单独诱导胞内信号通路。因此Annexin A2可能需要一种可以诱导胞内信号的“衔接蛋白”(或共受体)。近期研究发现，跨膜蛋白TLR4可能充当这种角色。

3 TLR4与aPL诱导的细胞激活:体外研究

3.1 内皮细胞 Raschi等［14］人运用内皮细胞株HMEC-1研究发现，APS病人来源的抗β2GPI单克隆抗体和经过抗原纯化的抗β2GPI多克隆抗体与LPS或IL-1激活内皮细胞后具有相同的信号通路。MyD88或 TRAF6敲除之后，抗 β2GPI抗体与 LPS或IL-1失去诱导的内皮细胞NF-κB活化的能力，对IRAK磷酸化研究显示LPS和抗β2GPI抗体具有相同时间动态。Raschi等的研究结果说明β2GPI抗原抗体复合物绑定内皮细胞后，可通过与Toll样受体(TLR)有关的MyD88依赖途径导致NF-κB活化，并提示有可能是TLR4在信号通路中起到关键的作用。

这些数据并没有证明TLR4直接绑定β2GPI，还是由于其它细胞表面受体与β2GPI结合，TLR4作为共受体激发胞内信号通路。Zhang等［15］在随后的实验中将内皮细胞HUVEC来源的Annexin A2经亲和纯化后固定在Affi-Gel HZ柱上，通过洗脱、SDS-PAGE和LC-MS分析后发现TLR4能与Annexin A2发生免疫共沉淀。这些发现初步证实TLR4可能参与Annexin A2介导β2GPI抗原抗体复合物激活内皮细胞。

最近，Allen等［16］进一步证实TLR4在抗β2GPI抗体激活内皮细胞过程中扮演关键角色。TLR4可以和Annexin A2、calreticulin及 nucleolin以多聚蛋白信号复合体的形式存在于在静息的HUVEC表面，在羊抗人β2GPI抗体激活HUVEC过程中多聚蛋白信号复合体表达增加，通过RNA干扰技术敲除此多聚蛋白信号复合体中任一蛋白的表达，均会明显抑制抗β2GPI抗体诱导的内皮细胞 E-selectin、ICAM-1、VCAM-1、TF mRNA 表达及 NF-κB 活化。然而Calreticulin和nucleolin在抗β2GPI抗体激活内皮细胞过程中的具体生物学功能并不清楚。

3.2 单核细胞 抗β2GPI抗体激活内皮细胞是APS血栓病理形成机制的其中一个假说［17］。单核细胞表面也存在抗β2GPI抗体，它通过Annexin A2和TLR4作为受体进行交叉反应。Sorice等［10］研究表明静息状态下的人单核细胞脂筏内，β2GPI以二聚体的形式与Annexin A2相互结合。LPS或来源于有血栓史APS病人血浆的抗β2GPI抗体激活单核细胞后，TLR4也被招募进脂筏并与β2GPI二聚体相互作用，β2GPI发生二聚化并且与被招募进脂筏的TLR4相互作用，导致IRAK磷酸化和NF-κB转位，最终导致细胞释放TNF-α和TF，引起促炎症反应和血液高凝。TLR4与β2GPI结合需要脂筏的完整性，脂筏破裂剂 mβCD可以减少 TLR4与β2GPI结合，抑制抗 β2GPI抗体诱导的 IRAK磷酸化。

本课题组对于TLR4在抗β2GPI抗体激活单核细胞中的作用进行了探讨。实验中用兔抗体人β2GPI抗体刺激人单核细胞株THP-1，并加入外源性人β2GPI共同孵育，结果发现，β2GPI抗原抗体复合物能够产生与LPS相同的刺激效应，显著增加细胞 TLR4、MD-2和 MyD88 mRNA及蛋白表达水平，诱导IRAK1磷酸化和TRAF6泛素化，最终导致TF mRNA 表达增强、活性增高［18，19］。为充分阐明TLR4及其信号分子在β2GPI抗原抗体复合物刺激THP-1细胞表达TF中的作用，我们还采用TLR4途径抑制剂--紫杉醇，观察对细胞表达上述分子的影响。紫杉醇(paclitaxel)是一种常见的抗癌药，可以通过与MD-2结合，掩盖TLR4配体的受体结合位点而起到抑制 TLR4信号通路的作用［20，21］。利用紫杉醇这一特性，观察紫杉醇是否干预β2GPI抗原抗体复合物对THP-1细胞的作用。结果证明，紫杉醇不仅抑制了β2GPI抗原抗体复合物诱导的TLR4、MD-2、MyD88表达，也抑制了 IRAK1磷酸化和TRAF6泛素化，同时也干预了细胞TF的表达。

我们通过β2GPI-Affi-Gel柱亲和层析证明Annexin A2和TLR4均可以与β2GPI在THP-1细胞表面发生结合。慢病毒 LV-Annexin A2-RNAi干扰THP-1细胞后，β2GPI抗原抗体复合物刺激细胞TLR4、MyD88及MD-2表达的作用明显减弱，IRAKs和TRAFs表达和活性被抑制，最终也干预了细胞TF的表达。我们认为THP-1细胞表面TLR4部分依赖Annexin A2，在β2GPI抗原抗体复合物诱导THP-1细胞表达TF过程发挥重要作用［18，19］。

4 TLR4与aPL诱导的血栓:体内研究

为了证实TLR4在aPL诱导内皮细胞激活和体内血栓形成中的作用，Pierangeli等［22］观察了aPL诱导LPS非反应性小鼠(C3H/HeJ小鼠)血栓形成的能力。C3H/HeJ小鼠细胞由于编码TLR4胞内段的基因区发生错意点突变而不能对LPS作出反应。与健康患者IgG片段和aPL阴性SLE患者IgG片段相比，APS患者中的IgG片段引起LPS+/+小鼠产生更大的血栓，小鼠提睾肌微循环中的内皮细胞上黏附了更多白细胞。这些效应通过亲和层析去除抗β2GPI活性后消失。与 LPS+/+小鼠小相比，LPS-/-小鼠注射IgG-APS后产生更小的血块，黏附更少的白细胞，颈动脉匀浆中产生更少的TF。这些发现强有力地说明了aPL介导的血栓形成效应，aPL特别是抗β2GPI在体内能激活内皮细胞，TLR4基因自发突变导致的细胞信号通路缺陷能显著降低aPL诱导血栓效应。

5 二次打击理论与TLR4的保护性基因多态性

虽然APS被认为是一种自身抗体介导的疾病，抗磷脂抗体在APS中起主要作用，但临床观察发现，APS患者血液中持续表达aPL，而血栓形成只是偶尔发生。因此提出二次打击理论，认为aPL形成的第一次打击是血栓形成的高危因素，而临床血栓发生还需要其他条件形成二次打击。

前期的实验表明aPL诱导的APS动物模型发生血栓需要炎症形成的再击效应，如机械创伤和注射 LPS［22，23］。APS 患者急性血栓形成通常和近期感染有关。研究表明LPS能增强aPL诱导中性粒细胞表达L-选择素、IL-8，并能与 β2GPI结合导致TLR4依赖的巨噬细胞活化［24，25］。这些证据表明炎症作为第二种致击物，引发aPL相关的血栓事件发生。TLR4对诱导快速炎症反应和激活免疫系统的效应细胞起到关键作用。由于TLR4基因多态性可能减弱对配体的快速反应，在细胞水平减弱炎症应答，从而改变感染性疾病和炎症性疾病的易感性［26］。

“保护性”的TLR4单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)同样导致APS病人aPL诱导血栓形成效应的不同易感性。Pierangeli［22］的数据显示有血栓史的APS患者TLR4 Asp299Gly和Thr399Ile突变的频率显著低于有同样突变的健康质控。Cimaz等［27］调查了 IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-6、IFNγ、IL-10和TLR4基因多态性的家族分布。非保护性野生型TLR4基因和高促炎症反应相关的细胞因子多态性(IL-1β promoter-511 C/T;TNF-α G/A;TGFβ +10 T/C，+25 C/G;IL-6-174 C/G)仅存在于反复发生血栓的先证者，而保护性TLR4基因多态性更多的出现在无症状的aPL携带者。总之，APS患者炎症反应中的保护性TLR4基因多态性将减少炎症因子激发炎症反应的级联放大效应，使aPL阳性患者发生血栓的风险性降低。

6 TLR4介导的信号转导通路的相关阻断研究与APS治疗

目前针对APS的治疗，主要是依赖长期的抗凝防止血栓发生，及孕期使用肝素和阿司匹林防止流产。这些治疗并非有效，有出血等副作用，因此迫切需要新的治疗方法，特异性干预APS病理过程。随着对TLR4介导的信号转导通路在APS发病机制中的作用的不断深入，在治疗方面除传统药物外，抑制此通路的关键环节或关键分子以抑制APS病人的血栓发生是众多学者研究的新方向。

体外实验表明，β2GPI和TLR4间的交叉反应在诱导细胞激活和APS促凝血表型中起关键作用，脂筏破裂剂mβCD、TLR4封闭抗体和TLR4干扰RNA等任何可以介入该机制的方法均可用于阻断或降低aPL介导的“第一次打击”，阻断或减少aPL诱导的血栓效应和炎症反应［10，16，28］。TLR4 下游重要的信号分子MyD88、IRAK1和 TRAF6在 APS中的作用也已经证明，抑制这些关键分子的表达或活性，同样可以阻断aPL诱导TLR4信号转导，最终减少TF表达［2，29，30］。

MAPK途径和NF-κB途径作为包括TLR4信号通路在内的多条信号通路的终末途径，在APS病理机制中的关键角色在体内和体外实验中都已得到证实，其中P38 MAPK、ERK1/2参与aPL诱导的血小板和多种细胞的激活，而JNK的作用尚无定论［31］。虽然小鼠体内实验证实抑制 P38 MAPK、NF-κB能显著减少aPL诱导的血栓发生，但由于MAPK途径和NF-κB途径存在复杂的调控，临床治疗的长期有效性还需进一步观察。由于APS患者需要长期抗凝治疗，TLR4作为固有免疫的重要防线，因此在进行针对TLR4及其信号途径的免疫治疗时，还要考虑治疗的安全性。APS患者aPL介导的血栓发生与TLR4基因多态性存在关联，因此TLR4多态性分析可以作为一种新工具对APS患者发生血栓的可能性重新评估，并以此调整抗凝药物的用量。

7 结语

综上所述，TLR4在APS的发生、发展中发挥着重要作用，为深入阐明该病的发病机制和拓展治疗方法提供了新的方向。TLR4的研究仍然存在许多问题，目前主要局限于基础研究，真正能应用于临床的成果尚少，如何提高APS血栓和流产的防治效果并研究新的治疗方案有待进一步探讨。

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