浅谈止血药凝血酶的研究进展

张松达

（青海省第四人民医院药械科，青海 西宁 810000）

浅谈止血药凝血酶的研究进展

张松达

（青海省第四人民医院药械科，青海 西宁 810000）

凝血酶是机体凝血系统中的天然成分，是一种生成于损伤处血管内皮细胞的多功能蛋白酶，它是参与凝血过程各个环节反应中的关键酶。本文介绍了凝血酶的结构、性质、在体内凝血机制中的作用及临床应用，并分析了其作为一种重要的外伤止血药的生产现状和前景。

止血药凝血酶；凝血机制；凝血酶原

止血药广泛用于临床各科，如内科、外科、妇产科、五官科、烧伤科等。但血液的凝固（凝血）过程是由许多凝血因子参与的复杂的酶反应，最终产生不溶解的紧密稳定的纤维蛋白多聚体，一般有如下3个阶段:第一阶段为凝血酶原激活物的形成，包括内源性和外源性两条途径；第二阶段为凝血酶原激活物催化凝血酶原转变为凝血酶；第三阶段为凝血酶催化纤维蛋白原转变为纤维蛋白，形成冻胶状血块。

1939年，美国学者Seegers 等人首次从血清中成功地分离出凝血酶，并应用于临床，对肝脏实质性出血和骨髓出血的止血取得了明显效果。随后Rogers将凝血酶用于消化道亦获得确切疗效。1944年相继有人用凝血酶进行手术创面的止血，均获得明显效果，美国药典于1950年开始收载此药，继而英国药典，日本药局方（日本药典）等亦予收载。自80年代末以来，国内厂家相继开发成功，并广泛用于临床各科。中国药典委员会和卫生部于1993年12月颁布了“凝血酶”国家标准（93）卫药标字03号，并规定从1994年1月1日起执行。同时废止该药的所有地方标准。《中华人民共和国药典》1995年版第二部已收载该药。

权所1 止血药市场潜力巨大

止血药是通过收缩小动脉及毛细血管，或增强血小板功能，或加速、加强血液凝固过程，或抑制血块溶解过程而产生止血作用。目前国内临床常用的止血药约有20多种，根据作用于凝血机制的不同环节，分为四大类。①促凝血因子活性药：代表药物有血凝酶、去氨加压素、维生素K1、维生素K3、维生素K4、甘氨酸乙二胺等。②降低毛细血管通透性药：代表药物有卡巴克络、卡络磺钠。③抗纤维蛋白溶解药：代表药物有氨基己酸、氨甲苯酸、氨甲环酸、抑肽酶等。④其他外用止血药：有可吸收创面的止血封固剂、明胶海绵、吸收性止血绫、小蘖胺、云南白药、止血粉8号、止血消炎贴等。

有资料显示，目前我国每年需治疗出血的患者总数大约有900多万人以上，主要集中在手术科室以及部分内科科室，在多种止血方法中，止血药被广泛使用。由于止血药的止血特性在临床上属于必用产品，且无可替代，因此在临床上使用的顺应性非常强。据中国药学会最新公布的2005年上半年全国16个重点城市典型医院止血药统计数据显示，凝血酶类药物在止血药市场中份额高达60%。

2 凝血酶的药理作用

2.1 凝血酶作为凝血因子Ⅱa，可不需经过血液凝固的第一、第二阶段而直接作用于纤维蛋白原，使之转变为纤维蛋白，使血液快速凝固、填塞出血点而达到止血的目的。因其作用于止血的最后环节，故不需其他众多因子的参与。

2.2 激活凝血因子Ⅶ，后者可使溶性纤维蛋白转变为难溶性纤维蛋白，形成凝血块。

2.3 增强凝血因子XⅢ和V的活性，后者在Ca2+和凝脂参与下促进凝血酶因子Xa形成，使凝血酶原转变为凝血酶。

2.4 促进血小板发生不可逆的聚集和血小板释放效应，加速血液凝固。

2.5 促进上皮细胞生成，减少创面渗出，可使创面愈合时间缩短约一半。

3 凝血酶的生产现状

目前国内外主要从动物血浆中及人血浆中制备凝血酶原，凝血酶原（prothrom bin） 即凝血因子Ⅱ是最早被提纯和测定氨基酸序列的凝血因子。它是单链糖蛋白，在正常人血浆中的浓度为150～200mg/ L。凝血酶原属于依赖维生素K的凝血因子。在血液凝固过程中，凝血酶原被磷脂膜表面形成的因子xa、因子va 复合物（凝血酶原复合物；prothrom bin asecomplex）激活而转变为凝血酶，从而在凝血共同途径中发挥重要作用。

从动物血浆中及人血浆中制备凝血酶原，再经激活物激活而成为凝血酶。它可直接催化血纤维蛋白原血纤维肽A和B的断裂，转变成不溶性血纤维蛋白凝块。从血液中提取分离凝血酶，凝血酶原的激活是影响提取得率的关键步骤。其激活方式较多，一般采用凝血因子Xa、凝血因子V、Ca2+和磷脂进行激活、也有采用蛇毒、25%柠檬酸钠、脑粉和肺提取液来进行的。目前国内有文献报道，酶原激活的最佳条件为：CaCl2浓度为1.0% ，时间为15min，温度为37℃。且该工艺已应用于规模化生产。此工艺形成凝血酶的过程比较复杂，凝血酶原先在Ca2+的作用下水解释放出糖多肽，并转换成中间产物II。此中间产物在Ca2+的作用下，肽链内部裂解成凝血酶，而凝血酶又可自身催化凝血酶原变成中间产物I，中间产物I在Ca2+的作用下又转变成中间产物II，再进一步转变成凝血酶。

4 基因工程生产重组凝血酶的前景

从国外许多文献报道可知，目前已有几种哺乳动物细胞系统用于表达凝血酶原和它的变异体。最终凝血酶产量大约在0.5～8υg每毫升细胞培养液。但由于表达量较低的原因，目前还无法用于产业化生产。另外也有用大肠杆菌表达凝血酶前体-2 （preth rombin-2）的报道，产量大约是每升细胞培养液能纯化得8mg unfolded protein。

prethrom bin-2是一种较短的凝血酶单链前体，共有308个氨基酸残基[1]。其在体内受到凝血因子FXa的作用而激活，凝血因子FXa 有特异的识别序列，在FV，Ca2+，磷脂等凝血酶原复合物的共同参与下，可特异性的切开prethrom bin-2 中的Arg-Ile。形成与有活性的凝血酶相同的空间结构。

重组prothrom bin和prethrom bin-2则必需经其他方式在体外进行激活，目前研究较多的体外激活方法是借助于一些蛇毒的作用。由于蛇毒中含有许多活性因子成分，能作用于多种与凝血和抗凝血有关的蛋白和酶，因而能对机体的止血机制产生影响。国外已有许多研究肯定了蛇毒能激活prethrom bin-2，得到与天然蛋白活性一致的重组凝血酶[2]。

目前用于prethrom bin-2的应用最广泛的表达系统是E.coli. 选择E.coli.做为表达载体的技术已成熟稳定，操作具有较为简便的优势，但同时也有其不足之处，主要体现在纯化阶段的操作较为麻烦。因为，prethrom bin-2，在正常情况下可溶的真核系统的蛋白，在E.coli.的表达中却往往形成不可溶的包涵体。因此，在纯化时不得不进行超声波破碎等处理。另外，由于E.coli.不具备真核系统所特有的二硫键修饰作用，其所表达出的目的蛋白无法形成与天然蛋白一致的二硫键，以上操作，必将增加纯化阶段的工作和难度，并且，过多的步骤也必定会对目的蛋白的稳定性和得率产生不利的影响。

尽管如此，虽然目前血液资源的综合利用在不断发展，但血液资源仍不是十分丰富，因此随着研究的进展，人们应用细胞工程和基因工程的方法制备凝血酶，来取代传统的生化提取，仍然在现代生物制药产业中具有良好的前景。

[1] 罗华,梁瑛.凝血酶激活的纤溶抑制物: 新的凝血纤溶调控因子[J].基础医学与临床,2003,23 (5):484-489.

[2] 栾菲菲,于龙胜.凝血酶的临床应用[J].山东医药工业,1998, 17(3):31-32.

R973.1

A

1671-8194（2013）16-0098-02