全麻机制研究——细胞内钙离子信号通路研究进展

常 晶，陆 菡，于布为

(上海交通大学医学院附属瑞金医院麻醉科，上海 200025)

随着全身麻醉药物的发展，全身麻醉由于其安全、舒适、无痛，已在临床中得到广泛应用。但是全身麻醉药物作用机制的研究并没有统一定论，对于其确切的分子和细胞作用机制仍存在争议。目前普遍认为，全身麻醉药物通过抑制兴奋性神经元受体如AMPA受体(a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxa-zolep-propionate receptor，AMPAR)或易化抑制性神经元受体如GABAA受体(gamma-aminobutyric acid A receptor)来发挥作用，其中全身麻醉药物对神经递质释放的影响长期受到广泛关注。

细胞内游离钙离子是细胞内重要的信使。钙离子可以通过激活神经元促进神经递质释放，从而使得全身麻醉药物调节细胞内钙离子浓度成为潜在的全麻重要机制。在真核生物细胞，包括神经元细胞，主要通过跨膜通道使游离钙离子进出细胞，并通过多种钙离子转运体系控制细胞内钙离子浓度(［Ca2+］i)，而［Ca2+］i浓度升高即构成了细胞信号转导的基础［1］。本文将对调节细胞内钙离子浓度的不同体系及全身麻醉药物如何通过作用于这些体系来影响［Ca2+］i做一综述。

1 钙离子内流系统(Ca2+influx system)

细胞可以通过许多机制调节胞内游离钙离子浓度，如电压门控型钙离子通道(voltage-gated calcium channels，VGCC)［2］，钠-钙 逆 向 转 运 体 (sodium-calcium exchanger，NCE)［3］，允许钙离子通过的AMPA型谷氨酸受体(calciumpermeable AMPARs)［4］，及存在于生殖系统介导钙内流的CatSper通道［5］等。在这些机制中VGCC和NCE是已知的研究比较集中的两种钙离子内流体系。它们也被认为是全身麻醉药物发挥突触前效应的潜在作用位点。

1.1 电压门控型钙离子通道(voltage-gated calcium channels，VGCC)VGCC属于大分子量超家族(200～500 ku)的成员，其上有许多糖基化位点，由5个亚基α1、α2、β、γ和δ构成［6］。脊椎动物体内包含多种钙离子通道，可按照电生理特性、基因分类及结构特点的不同将其进行命名［7］。例如依据电生理特性，钙离子通道可分为低电压激活(low-voltage activated，LVA)快反应通道及高电压激活(high-voltage activated，HVA)慢反应通道。而较常用的是按照抑制剂不同来分类［8］:可分为 N-型、T-型、L-型(3 者对二氢吡啶类敏感性不同，激活与灭活电位存在差异，并且N-型随后被证明对多肽类毒素ω-conotoxin GVIA敏感);P-型(对ω-Aga-IVA抑制剂敏感);Q-型(存在于小脑神经元)［9］;R-型(对毒素 ω-Agatoxin-ⅢA敏感)。其中LVA通道或T-型钙通道所呈现的电压依赖性失活的快反应模式，被认为是中枢及外周神经元的膜电位波动的主要参与者。

关于全身麻醉药物的突触前效应存在许多不同观点，而VGCC被认为是潜在位点之一。麻醉药物可能通过抑制VGCC减少钙内流，从而进一步干扰神经递质的释放:钙离子通道开放诱发钙离子流渗入通道，在局部小范围内达到细胞内钙阈值(～100 μmol·L-1)，随之迅速引发对入胞的钙离子敏感的突触前结合蛋白产生胞吐作用，促使神经递质释放［10］，而麻醉药物抑制了该通道的开放。因此VGCC作为快速突触传递的结构基础可以介导麻醉药的突触前效应。

1.2 钠－钙逆向转运体(sodium-calcium exchanger，NCE)NCE是调节心肌细胞钙离子动态平衡的重要膜蛋白，担负着心肌正常收缩的重任。事实上心肌细胞的兴奋-收缩偶联很大程度上取决于钙内流的变化，而电压门控型钙离子通道及钠钙交换体是唯一已知的两种心肌细胞钙内流机制［3］。

1.3 全身麻醉药物对钙内流的影响 2002年，Yamakage等［11］指出吸入性麻醉药可以抑制VGCC的内流钙离子流，从而抑制了突触的信号转运。Xie等［12］采用fura-2荧光标记法观察牛嗜铬细胞［Ca2+］i，发现异氟醚使细胞内钙离子浓度增加，并进一步发现这种增加在很大程度上是由VGCC介导的。随后Herring等［13］经过实验证实了临床浓度的异氟醚抑制神经递质释放的机制在于直接提高PC12细胞及海马神经元细胞［Ca2+］i。事实上，全身麻醉药对HVA钙离子流的作用已经在许多细胞中得到证实，如神经元细胞、神经内分泌细胞、嗜铬细胞、甲状腺C细胞、心肌细胞及平滑肌细胞［14-16］。最新的研究表明［17］，异氟醚可以明显抑制丘脑皮质神经元细胞膜T-型钙通道的峰电流，并通过随后的生物物理学研究指出这种抑制在细胞膜去极化时更易发生。

吸入性麻醉药对心肌NCE有抑制效应。Seckin等［18］通过实验证明，氟烷及较低浓度的七氟醚可以抑制NCE。同时指出吸入麻醉药对心肌整体的抑制并不单纯取决于NCE，而是通过抑制VGCC、NCE及肌浆网钙离子释放而共同起作用。近年来，随着吸入性麻醉药心肌保护机制研究逐渐深入，心肌细胞线粒体游离钙离子成为吸入麻醉药对心肌缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，IR)损伤发挥保护作用潜在的下游靶点，Agarwal等［19］最新研究表明异氟醚通过抑制NCE介导了其对心肌IR损伤的保护作用。

丙泊酚对于钙内流的影响至今存在争议。早在1994年，Anders等［20］就采用Fura-2及单细胞荧光显微镜技术研究了丙泊酚对多种细胞［Ca2+］i影响，研究指出丙泊酚可以增加大鼠胚胎神经元细胞及人神经胶质细胞内钙离子浓度，促进钙内流。然而Kim等［21］指出丙泊酚可以对新生大鼠心室肌细胞的IR损伤起到保护性作用，这种作用一部分原因可能是通过抑制钙内流降低钙超载。国内也有文献报道丙泊酚抑制了细胞的钙内流［22］。笔者认为，造成差异的原因主要有以下几点:其一，各实验所选取的细胞种类不同，可以初步认为丙泊酚对不同种类的细胞Ca2+内流作用不同。丙泊酚由于抑制了心肌细胞钙负载(Ca2+overload)从而发挥其对缺血/再灌注心肌的保护作用，但对神经元细胞的钙内流起了双向调节作用。其二，各实验所选用的丙泊酚浓度不同。丙泊酚发挥心肌保护作用时的血浆浓度远高于其发挥临床麻醉作用的血浆浓度［21］。其它原因，如测定［Ca2+］i方法的差异，细胞处理方法的差异等。

2 钙离子外流系统(calcium efflux system)

尽管受到多种因素的刺激后细胞内钙离子浓度增加，但是细胞可以迅速的进行自我调整，以维持胞内较低的钙离子浓度，这依赖钙离子外流系统［23］。钙离子外流系统主要包括胞质膜Ca2+-ATP酶、NCE、线粒体及内质网吸收钙离子等。其中Ca2+-ATP酶占主导作用。

2.1 胞质膜 Ca2+-ATP酶(plasma memberane Ca2+-ATPase，PMCA)PMCA对钙离子具有很强的亲和力，主要负责在胞质游离钙离子浓度较低时将内流入胞质的钙离子通过电压门控型钙通道或脂质门控型钙通道排除胞质外，以维持胞质低钙离子浓度。相比之下NCE虽然具有较高的效能，但其对钙离子亲和力较低，主要负责胞质游离钙离子浓度较高时(＞1 μmol·L-1)排出钙离子。

许多文献证明了PMCA在钙离子负载时维持神经元胞质内低钙浓度的重要性。早在1992年Benham等［24］证实在体外培养的钙负载小鼠背根神经节细胞中，维持细胞内低钙浓度的活动中NCE只占小部分，而PMCA占主要部分。随后Drago等［25］评估了钙离子外排系统后得出同样结论:PMCA介导的钙离子排出是在接受刺激后恢复细胞及线粒体内基础钙浓度的主要步骤。这些研究共同表明PMCA在恢复细胞内钙离子浓度发挥了独特的作用，而其它体系如NCE、线粒体、内质网在细胞内钙离子少量增长时迅速排出过程中起的作用并不突出。

2.2 全身麻醉药物对胞质膜Ca2+-ATP酶的作用 细胞内钙离子浓度以及细胞兴奋性的变化可以引发神经递质释放入突触间隙，使得人们注意到全身麻醉药物引起神经元PMCA变化也许是其发挥麻醉作用的潜在机制。2000年，Brennan等［26］通过电泳及免疫印记的方法证实随着氟烷浓度的增加，骨骼肌PMCA的异构体SERCA1外在的单体数目被明显抑制。同时指出氟烷在5 mmol·L-1及25 mmol·L-1浓度时PMCA异构体SERCA的活性分别降低27%及53%。随后Kim等［21］采用RT-PCR方法研究维持Ca2+稳态的相关基因，研究表明与正常心肌细胞相比，IR细胞肌浆网Ca2+-ATP酶(SERCA2a)，L-型钙通道及肌纤维膜上Ca2+泵(PMCA1)的基因表达都减少，其中SERCA2a转录水平最低。

3 细胞内钙离子的储存(intracellular calcium stores)

如前所述，对于钙内流体系的相关研究有很多，相较之下关于细胞内钙离子储存系统内质网的研究偏少，但是内质网作为钙离子的源泉其重要性不容忽视。内质网膜上含有三磷酸肌醇(1，4，5-trisphosphate，IP3)及 Ryanodine(RYD)受体，负责将储存的钙离子释放入胞质。两种受体都依赖于钙触发钙释放(Ca2+-induced Ca2+release)模式，受钙离子负荷量及许多因子(如三磷酸肌醇IP3，二磷酸腺苷ADP)的调节［27］。外源信号作用于细胞外周的受体，使磷酸肌醇4，5-二磷酸水解产生第二信使(二酰甘油和IP3)。IP3弥散入细胞内，通过激动内质网上的IP3受体引发Ca2+释放。RYD受体是最先发现的调节骨骼肌和心肌细胞肌浆网Ca2+释放的受体。可分为RYD1(骨骼肌)、RYD2(心肌)及新发现的RYD3(仅在脑，平滑肌和一些非兴奋性组织中表达)。

已有研究表明，吸入性麻醉药可以刺激多种细胞内质网IP3受体或RYD受体释放Ca2+，如心肌、骨骼肌、血管平滑肌以及神经细胞。2001年Allansson等［28］将体外培养的初级星形胶质细胞急性暴露于乙醇中，发现乙醇可以通过激活细胞内钙离子储存系统从而增加［Ca2+］i。Dou等［29］通过记录全细胞K(+)和Ca(2+)电流指出静脉麻醉药硫喷妥钠所诱导的胰岛素分泌是通过激活细胞内IP3敏感的钙离子储存系统，而并非由VGCC介导的钙内流所控制。但是对于全身麻醉药物影响内质网Ca2+离子释放及神经元［Ca2+］i效应也存在争议，全身麻醉药物对细胞钙离子储存系统的影响仍需要进一步的研究。

钙离子信号通路及其所影响的神经递质的释放为全身麻醉药物作用机制的研究提供了方向和思路，通过十几年的研究，也取得了很大的进展。然而正如前面所提到的，许多结论的相关依据并不充足，很多问题的研究仍存在争议。在发挥心肌保护作用时的丙泊酚血浆浓度会对神经系统造成何种影响?吸入麻醉药引起的［Ca2+］i增加的确切机制是内流增加还是外排减少?钙储存系统在［Ca2+］i增加中发挥了多大作用等相关问题需要我们对全麻机制相关的细胞内钙离子动态变化及随之引发的神经递质释放的变化进行更加深入的探讨。

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