Cullin蛋白在生殖系统中的研究进展

田 烨，赵 涵，陈子江

山东大学附属省立医院生殖医学中心 国家辅助生殖与优生工程技术研究中心生殖内分泌教育部重点实验室 山东省生殖医学重点实验室，济南 250021

泛素化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式，E3泛素连接酶决定了泛素化过程的特异性。高等真核生物体内存在1000多种E3泛素连接酶，其中Cullin-Ring类E3连接酶 (cullin-ring-based E3-ligases，CRLs)占主体地位［1］。Cullin蛋白作为支架参与CRLs蛋白复合体的构成，在DNA复制、细胞周期、DNA损伤修复、肿瘤抑制、生长发育、信号转导、转录调节等过程发挥重要调节作用。

CRLs家族成员是以蛋白复合体形式存在，包括小RING蛋白 (ROC1、ROC2)、Cullin蛋白、linker(如SKP1、ElonginB/C、DDB1等)和底物识别亚单位 (substrate recognize subunit，SRS)，如:F-box、DCAF等。Cullin蛋白发挥着支架作用，其本身不含有RING结构域，而是在C端结合1个含有RING的小蛋白ROC1/ROC2，在人体内共存在7种Cullin蛋白，CUL-1、CUL-2、CUL-3、CUL-4A、 CUL-4B、CUL-5、CUL-7［2］。与其他E3类泛素连接酶不同，CRLs家族成员并不和底物直接结合，而是通过一系列SRS特异性结合底物，从而使泛素从E2结合酶转移到底物上。其中，已被解析结构的CRL主要有CUL-1参与的SCF复合物 (F-box/SKP1/CUL-1/ROC)的晶体结构、CUL-4A参与的CRL-4s复合物 (DCAF/DDB1/CUL-4A/ROC)的晶体结构［3］，因此两者在结构及功能学上的研究较为深入。

CUL-1与SCF复合物

CUL-1可与Skp1、ROC、F-box共同构成SCF复合物，SCF是研究最多的E3连接酶，因此对SCF复合物中除CUL-1之外其他组分—F-box与生殖系统疾病的关系略作介绍。F-box发挥着特异性识别底物的作用，目前已鉴定的人体内F-box有70余种，在生殖系统中与配子的发生［4］、减数分裂［5］、卵子的储备［6］有关。

CUL-1与胚胎发育 CUL-1是SCF复合物中的支架蛋白，和胚胎的早期发育密切相关。Pennetier等［7］发现和肠、肺、骨骼肌等的体细胞相比，在牛的卵母细胞中CUL-1有明显的表达优势，这种空间表达特异性提示CUL-1可能在配子的发生、受精及早期胚胎发育中有重要作用。另外，在CUL-1基因敲除小鼠在胚胎第6.5天原肠胚形成之前胚胎发育停止，CUL-1－/－鼠囊胚体外培养时可观察到其增殖能力下降，这说明CUL-1在哺乳动物胚胎的早期发育中发挥重要作用［8-9］。

F-box与生殖系统疾病 在SCF复合物中，Skp2是研究较多的一类F-box，可作用于下游的p27，在很多妇科肿瘤如宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌中均可检测到p27表达的下调及Skp2表达的上调，而且二者表达水平的改变和肿瘤的生物学行为 (浸润、转移)、肿瘤分级以及患者的预后等相关［10-12］。Skp2和卵巢早衰 (premature ovary failure，POF)可能相关，POF是指女性患者40岁之前提前绝经，内分泌学特点是雌激素水平低下而促性腺激素水平升高。有研究发现，Skp2基因敲除的小鼠胚胎期卵巢细胞凋亡增加，有功能的配子储备减少，从而导致性成熟后卵巢早衰出现［6］，但目前还未有 POF患者和Skp2相关的临床证据。

综上，从结构上来讲，CUL-1是SCF复合体不可或缺的组成部分;从功能上讲，CUL-1和胚胎的早期发育直接相关，而SCF复合体中F-box(Skp2)与宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌等妇科肿瘤发生、发展相关，与目前病因并不明确的可表现为妇科内分泌异常的疾病卵巢早衰可能有一定相关性，为明确其病因提供了新的线索，而CUL-1在生殖系统疾病中的功能有待进一步研究。

CUL-2和CUL-5

减数分裂与卵的产生 CUL-2和CUL-5在生殖系统中的功能研究多数来自模式生物—秀丽隐杆线虫和黑腹果蝇。在秀丽隐杆线虫中，CUL-2和减数分裂及胚胎的极性相关［13］，CUL-2失活可导致 CyclinB1降解异常，致使减数分裂停滞在Ⅱ期中期;此外，还可观察到胚胎极性的逆转。既往研究认为，Rbx2-CUL-5 based E3泛素连接酶复合体中CUL-5或Rbx-2均不是生长发育所必须的。而随后对CUL-5功能的进一步研究发现，CUL-5和CUL-2之间有复杂的相互关系，野生型线虫可产生约300个卵，CUL-5完全敲除的线虫卵的产生不受影响，CUL-2完全敲除后仅产生约50个卵;而CUL-2完全敲除后用RNAi部分干扰掉CUL-5或者Rbx-2后线虫表现为完全不育，但CUL-5和CUL-2之间的相互作用的具体机制尚不清楚［14］。对于黑腹果蝇的研究发现，CUL-2、CUL-5与卵巢的发育有关，CUL-2在所有的生殖系细胞中广泛表达，CUL-2缺失后表现为多种发育缺陷主要是生殖细胞的减少和滋养细胞的变性，而CUL-5缺失后也观察到了相似的表型［15］。目前还未有CUL-2或CUL-5在人卵发生和成熟中功能的报道，或许人类卵子异常导致的不孕患者中可能存在CUL-2或CUL-5基因表达的异常。

CUL-5与卵巢异常囊样表型 成熟的果蝇卵母细胞源于被称为卵室的前体结构，每个卵室含有16个相互连接的包囊细胞，其外由卵泡上皮包被可形成包囊。仅1个包囊细胞进入减数分裂并发育为卵细胞，而另外15个变为滋养细胞［16］。当CUL-5发生基因突变时，卵室表现为异常增大的囊样结构，原因是生殖细胞的过度增殖和外面包被的卵巢上皮细胞分隔形成异常。卵室中的生殖细胞均多于16个，可达几十个。正常情况下，卵巢上皮细胞仅包被1个包囊细胞形成1个包囊，而CUL-5突变后，卵巢上皮细胞无法正常迁移至两个包囊之间，导致出现多个包囊细胞被包被在同一层上皮内［17］。在人类中，多囊卵巢综合征 (polycystic ovarian syndrome，PCOS)患者表现为卵巢多囊样外观，其多囊形成的机制仍未完全阐明，虽然人和动物之间的生理结构、疾病谱和其相应的病理生理过程都有很大差异，但来源于模式生物的研究结果具有一定的提示作用，将来或许有CRLs家族与PCOS发生发展的研究被报道。

CUL-3

对生殖系统的研究发现，CUL-3与精子发生、雄性不育密切相关。在小鼠中，CUL-3可在小鼠多种组织中表达，但主要分布于睾丸［18］，提示CUL-3的表达有一定的空间特异性。原位杂交在小鼠精子发育的各个阶段均检测到CUL-3 mRNA的表达，而仅在精子发生的后期有CUL-3蛋白表达。根据CUL-3的时间和空间表达谱，不难推断CUL3-based E3类泛素酶与精子的晚期发生有关，其表达的异常可能引起雄性不育。而且，在果蝇中的研究［19］也支持这一推论，不管是昆虫还是哺乳动物，精子发生的最后阶段都存在大量细胞质的丢失，在果蝇体内，这一过程需要凋亡蛋白caspase介导的细胞重构，研究证实CUL-3复合物可通过激活caspase而在果蝇精子发生的后期发挥重要作用。

CUL-4

在人体内主要包括两种CUL-4基因，即CUL-4A和CUL-4B，CUL-4B突变可引起X连锁智力低下［20］，表现为生长迟滞、躯干肥胖、巨头畸形、共济失调、震颤、性功能低下和男性乳房女性化，未有和人类疾病相关的CUL-4A的突变报道。目前在生殖系统中的研究表明，CUL-4主要是和雄性不育、性激素受体降解相关。

CUL-4A与雄性不育 CUL-4A敲除 (第4～8外显子敲除)的雄性小鼠不育和精子发生受阻［21-22］，表现为精子数目减少、活动力减弱及顶体产生异常。在精子发生过程中，CUL-4A-/-小鼠双线期的精子中，晚期重组相关的分子MLH1异常降解，而使随后的减数分裂Ⅱ期无法进行。较为有趣的是，CUL-4A第4-8外显子敲除的雌鼠可以怀孕并产下活仔，仅生育力轻度受损，可能原因为CUL-4A敲除后，CUL-4B可代偿其功能，而CUL-4B是X连锁的，所以雌雄有差异。

CUL-4A与胚胎发育 CUL-4A敲除 (第1外显子敲除)小鼠无存活的后代产生。性交后7.5 d(7.5 dpc)CUL-4A-/-胚胎已死亡，而4.5 dpc纯合突变的囊胚泡可存活，推测CUL-4A-/-胚胎在4.5～7.5 dpc之间死亡，因此认为CUL-4A与胚胎早期发育相关［23］。但是近年来此理论受到了质疑，因为CUL-4A基因敲除小鼠模型构建方式的不同而出现的结果不同，敲除CUL-4A外显子1后胚胎期致死，敲除外显子17～19无表型，敲除外显子4～8仅有小鼠胚胎纤维母细胞增殖有轻度上升。所以，CUL-4A在胚胎发育中的功能需要进一步探究。

CUL-4B与雄激素不敏感 关于CUL-4B和激素关系的研究较少，近期研究发现CUL-4B可以和芳香烃受体 (aryl hydrocarbon receptor，AhR)组成新复合物，特异性识别底物雌激素受体和雄激素受体，并介导其降解［24］。雄激素受体的异常和多种雄激素不敏感的疾病发生相关［25］，如抗雄激素综合征或者睾丸女性化，表现为女性外观，但是无子宫和输卵管，生殖腺为睾丸。Reifenstein综合征也存在雄激素受体功能缺陷引起的雄激素不敏感现象，临床表现为男性外观、泌尿生殖发育异常、生殖器女性化。CUL-4B可介导雄激素受体的降解，推测和雄激素不敏感的临床疾病可能有相关关系。

CUL-7

CUL-7在生长发育、细胞转化和p53调节等方面的作用已有较为详细的综述［25］。CUL-7是较晚开始研究的E3泛素酶，其在生殖系统中的作用涉及较少。CUL-7的作用底物胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate 1，IRS-1)是重要的胰岛素信号通路分子，CUL-7缺乏可引起胰岛素信号途径异常而出现生长发育缺陷［26］。此外，IRS-1丝氨酸的磷酸化等可引起信号向下游PI3K通路的传导受阻，进而导致胰岛素抵抗。胰岛素抵抗与多种代谢紊乱的疾病的发生相关，如PCOS。PCOS是一类病因复杂的代谢紊乱疾病，临床特点是高雄激素表现、卵巢多囊样变、稀发排卵，可有糖代谢紊乱、脂代谢紊乱并可伴有心血管疾病、妇科肿瘤等长期并发症。胰岛素抵抗是其最重要的病理生理机制之一，已有研究证实，IRS-1与PCOS中的胰岛素抵抗相关［27-28］，因此推测CUL-7-IRS-1调节通路可能与PCOS相关，CUL-7基因突变或表观遗传学修饰的改变可能通过调节IRS-1蛋白功能从而影响PCOS的发生发展。

总之，Culling蛋白是CRLs家族重要的组成部分，在生殖系统正常功能的维持中扮演重要角色，与妇科肿瘤、生殖与不育、妇科内分泌疾病有一定的相关性，对于POF、PCOS等病因复杂疾病的发生发展机制有一定提示作用。但目前多数研究仅局限在动物模型层面上，真正的临床研究较少，很多源于模式动物的结论和推论有待进一步证实。相信随着CRLs复合物结构的阐明、新的作用底物的发现以及临床研究的进一步深入，其在生殖系统及其相关疾病中的作用也会逐渐明确。

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