实验动物眼底血管荧光造影的研究进展

陈俊宏 李强 段俊国

眼底血管荧光造影(fundus fluorescein angiography,FFA)是一项最常用的眼底病变诊断技术,已成熟地在临床上应用。一般选择前臂正中静脉快速注射荧光素钠,注射后10～15s,开始每秒摄一张照片,直到循环结束[1]。其不但直观地、动态地观察眼底血管形态和病灶部位,而且可以记录检眼镜看不到的色素上皮和视网膜的循环的细节,对各种眼底疾病的诊断、鉴别诊断、临床治疗及预后都具有重要意义。在实验研究中,大部分眼底病动物模型的建立和药物治疗的作用效果都需要通过FFA评估。理想的FFA方法应具有操作简便、成功率高、各循环时间准确和荧光显影强等特点,但由于动物生理结构特点,不同方法的FFA各存难点。根据给药途径,实验动物FFA方法可分为:经尾静脉注射、腹腔注射、球后注射和口服给药行眼底血管荧光造影。

1 经尾静脉注射荧光素钠

尾静脉注射和人的肘正中静脉一样,直接进入体循环,可以迅速获得高浓度血中荧光素钠,故显影最强。缺点有:直接进入体循环易引起过敏;注射量过大易引起充血性心衰[2];尾静脉较细,对注射技术要求高,注射成功率偏低,反复注射易影响尾静脉-眼循环时间的统计。熟练的操作、使用较细的针头以及用温水浸泡尾部以扩张血管可以提高注射的成功率。张迁等在实验中给健康SD大鼠尾静脉注射100g/L荧光素钠注射液0.5ml/kg,经共焦激光眼底血管造影仪观察,最小可以看到4级血管(自视盘分枝算1级血管),并根据眼底血管的充盈和显像情况将循环分为早期相(注射后1～3s,可见1级血管),中期相(3s～5min,可见小血管,最小到4级血管),后期相(荧光素钠注入5min以后,视网膜血管显像和逐渐变亮的背景)[3]。赵英杰等报道,Wistar大鼠尾静脉注射最适剂量为40mg/kg(10%立摄得),尾-视网膜循环时间为6.6±3.0s,静脉层流时间为7.6±3.0s,视网膜静脉充盈时间为9.3±3.5s,视网膜循环时间为2.1±0.58s,荧光消退时间为18.1±5.1min[4]。

2 经腹腔注射荧光素钠

荧光造影剂注射后,经腹膜吸收进入体循环后到达眼球。腹膜吸收较缓慢,在短时间内视网膜荧光素钠浓度较低,故造影显影强度较弱,但持续时间较长。优势在于其操作简便,成功率极高,易于各组间循环时间的对比。赵英杰等发现,Wistar大鼠腹腔注射最适剂量为120mg/kg(10%立摄得),动静脉开始充盈时间为40.9±4.80s。荧光消退时间为20.4±2.70min[4]。李明铭等试验中,给氩激光诱导的脉络膜新生血管模型C57BL/6J小鼠腹腔注射1%荧光素钠0.3 mL后,观察激光渗漏以间接观测新生血管[5]。李岱等向半导体激光诱导的BN大鼠按0.5ml/kg向腹腔注射的10%荧光素钠以观察新生血管,视网膜显影至注射后的30min[6]。

3 经左心室内注射异硫氛酸葡聚糖荧光素钠

异硫氛酸葡聚糖荧光素钠是一种较高相对分子质量的荧光,不能穿过血管壁,到达视网膜血管后停留在血管壁上。此法重复性好,血管显影清晰、完全[7]。缺点是操作相对其他方法复杂,且必须处死动物,不能连续性观察不同时期同一个动物的眼底病变过程。此法将大鼠麻醉后,把异硫氛酸葡聚糖荧光素50 mg,溶于1ml的4% 多聚甲醛,直接左心室灌注,灌注后立即摘除眼球,放入4 % 多聚甲醛固定5 h,游离出视网膜,以视乳头为中心放射状切片、 铺片,滴少量甘油明胶,加盖玻片,荧光显微镜观察,并用数码照相机拍片,可以清楚观察到从中央部延续到周边部的整个视网膜血管形态、走行[8]。

4 经球后注射荧光素钠

球后注射后,荧光素钠由巩膜、脉络膜逐层向内弥散的过程中,在背景发亮的荧光衬托下可以显现视网膜脉、络膜及血管清晰轮廓,是一种“光化学巩膜透照法”。张四力等报告,家兔球后注射后30秒～30分钟立即可见到背景亮度增强,随即出现地图状强萤光衬托出脉络膜血管的阴影,到10分钟时,出现全亮背景。晚期出现全亮背景及视乳头着色,基本同于静脉法的晚期影象[9]。主要是脉络膜及脉络膜血管显影,可以作为脉络膜占位性病变和脉络膜血管病变的辅助诊断方法。此法成功率高,操作简便。但近年使用较少,主要由于视网膜血管显影不明显。

5 口服荧光素钠

口服荧光素钠后,通过胃黏膜吸收进血液入体循环后到达眼球。此法在1979年Kelley等首先报道后,已应用于临床。主要应用于一些有过敏史者、小儿老人血管不易寻找者或其他病史不能行静脉给药的患者。优点是简便、易行,适用于普查,几乎不发生过敏反应。缺点是由于胃一视网膜时间受多种因素影响[10],故视网膜出现荧光时间不具参考性;视网膜荧光没有静脉注射法显影强。Kelley明确指出人口服法渗漏从15 分钟开始显现,到1小时明显,到1小时的影象相当于静脉法7 分钟左右的影象[11]。此法应用于动物较少。张四力等给家兔应用此法,视网膜,脉络膜始终未见到明显的血管显影,但背景的亮度是逐浙增强的[9]。

6 小结

可行性、准确性、可重复性是科学实验的基本要素。如何确保实验动物FFA的可行性、准确性和可重复性,是实验最值得探讨的难题。以上FFA方法各有优劣,应该根据动物种类、实验目的、病变部位等差异选择最合适的造影方法,不应该盲目地应用统一的标准。比如大鼠由于血管较大,浸泡后能充分暴露,可以选择尾静脉注射法,小鼠选择尾静脉注射难度较大,更适合用腹腔注射法;如果我们要求对比不同组别动物的前期、动脉期、静脉期和晚期的差异,尾静脉注射法难以把握注射的准确性,影响各循环时间的计算,更适合用腹腔注射法以减少人为操作对各期时间的影响;病变在视网膜及其血管,静脉注射法显影最强,腹腔注射次之;病变在脉络膜,适合用球后注射和口服法;到实验的终末期,可以处死动物,经左心室内注射异硫氛酸葡聚糖荧光素行视网膜血管造影法将获得更直观、血管显影清晰、全视网膜造影范围的图片。

[1] 段俊国.中西医结合眼科学[M].北京:中国中医药出版社,2005:71.

[2] 潘怀耿.小鼠尾静脉注射方法与体会[J].卫生职业教育,2010,28(13):44-45.

[3] 张迁.大鼠视网膜微循环及白细胞运动初步研究[D].西安:第四军医大学,2009:3-6.

[4] 赵英杰.视网膜脉络膜荧光血管造影的实验研究[D].成都:华西大学,2004:1-9.

[5] 李明铭,王康,刘玉宣.氩激光诱导小鼠脉络膜新生血管形成[J].首都医科大学学报,2008,10,29(5):622-625.

[6] 李岱,曾水清,等.激光诱导鼠脉络膜新生血管的两种检测方法对比研究[J].咸宁学院学报,2005,19(6):465-468.

[7] D’Amato R,Wesolowki E,Smith EH Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the Mouse,Microvasc res,1993,46:135-142.

[8] 孔怡淳,韩梅,赵堪兴,等.小鼠视网膜新生血管模型荧光素灌注造影[J].中华眼科杂志,2006-2007,42(7):634-636.

[9] 张四力.动物实验比较三种给药途径的萤光血管造影术[J].内蒙古医学杂志,1985,5(1):1-5.

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[11] Jamess Kelley.etal:Retinal fluhorography using oral fluoescein[J].Ophthalmology,1980,87(8):805.