多系统萎缩动物模型研究及进展

郭俊猛， 耿云龙综述， 宋晓南审校

多系统萎缩(multiple system atrophy，MSA)是成年期发病、散发性的神经系统变性疾病，临床表现为不同程度的自主神经功能障碍、对左旋多巴类药物反应不良的帕金森综合征、小脑性共济失调和锥体束征等症状。已建立的动物模型以重现MSA的各种临床症状及病理特点为目的。本文列举了不同的MSA动物模型，描述了它们各自的优点、局限性及实用性以解释MSA的病理生理学意义，进而确定有效、对症且能够改善症状的治疗方法。

1 多系统萎缩概况

1.1 多系统萎缩的定义 多系统萎缩(Multiple system atrophy，MSA)是一组原因不明的、散发的、成人发病的神经系统多部位的进行性萎缩的变性疾病或综合征，其发病率约为4～5/10万人口［1］。

1.2 多系统萎缩的临床表现及治疗 MSA的临床症状常随着病情的发展、受累部位先后而表现为以自主神经功能障碍、帕金森病样症状和小脑综合征3种症状的不同组合。其中MSA两个主要的临床亚型为MSA-P(帕金森样症状为主要表现，即以往所称纹状体-黑质变性)和MSA-C(小脑症状为主要表现，即以往所称橄榄体-脑桥-小脑萎缩)［2］。此外，以往将自主神经功能障碍(被称为Shy-Drager综合征)也作为MSA的一个亚型，同时自主神经功能障碍也是其它MSA亚型的最常见症状之一，常见的临床表现有尿失禁、呼吸暂停、构音障碍、吞咽困难和立位性低血压。MSA没有固定的发病形式，不同患者可以以不同起病形式作为临床首发症状，自主神经功能障碍亦可发生在运动功能障碍之前［3］。MSA患者的平均寿命预期一般不超过9年［4］，目前临床上对自主神经功能障碍的治疗措施主要包括使用氟氢可的松治疗立位性低血压，抗胆碱能药物缓解排尿功能障碍［5］。临床上将左旋多巴作为治疗帕金森综合征的一线药物，但是大部分MSA-P患者对左旋多巴不敏感，大约只有20% ～30%的患者在使用左旋多巴2～3年以上后症状得到了缓解［6］。目前对多系统萎缩没有特效的治疗措施，但研究发现物理治疗对缓解共济失调和运动功能障碍有一定效果。

1.3 多系统萎缩的神经病理特征 MSA-P亚型是由纹状体和黑质变性引起的，其病理改变是在黑质致密斑和纹状体黑质有关的感觉运动区域的神经元逐渐丢失和退化，由于多巴胺能纤维终端缺失的部位主要集中在壳核后背侧，所以纹状体的神经元损失最为严重。MSA-C亚型是由橄榄体-脑桥-小脑萎缩引起的，其主要病理改变为下橄榄核和脑桥核神经元的缺失。小脑蚓部Purkinje细胞缺失程度比在小脑半球上更明显。多系统萎缩脑干神经病理改变包括对药物敏感的呼吸神经元的缺失［7］、脑干腹外侧一些中间神经元的缺失［8］、还有存在于脑干被盖部、锥体周围、延髓腹外侧的血清胺神经元的缺失［9］。脊髓的病理改变主要存在中间外侧细胞柱［10］。

多系统萎缩除了有神经元缺失的病理表现之外，还具有特征性病理性标志物-少突胶质细胞包涵体(GCIs)。我们将GCIs与帕金森氏病的特征性标志物Lewy小体这些神经胶质的包含物被看作为一类疾病的病理特征性标志。研究发现α-突触核蛋白是构成Lewy小体和GCIs的主要成分，所以我们把多系统萎缩、帕金森氏病、Lewy体痴呆这些由α-突触核蛋白(SYN)异常积聚所参与引起的神经系统变性疾病统称为“共核蛋白病”。目前认为正常脑组织或多系统萎缩脑组织中少突胶质细胞中的α-突触核蛋白基因本身是不表达的［11］，一般认为α-突触核蛋白构成少突胶质细胞包涵体是由于异常积聚。当前的研究证实了α-突触核蛋白在细胞与细胞间可以相互传输，从而支持了在多系统萎缩中少突胶质细胞内的α-突触核蛋白异常积聚通过α-突触核蛋白的吞噬细胞吞噬附近的神经元引起的假设。尽管多系统萎缩是一种散发的神经变性疾病，但是有一些证据提示多系统萎缩的发病机制可能与基因作用有关。最近一项基因组相关研究表明α-突触核蛋白的基因位点存在遗传变异性，这会增加多系统萎缩的发病危险［12］。此外，有研究对MSA患者的近亲进行了随访以确定是否有家族遗传倾向，并报告了MSA患者近亲中以帕金森样症状为发病形式的患者正逐渐增加，这些都进一步说明遗传因素在多系统萎缩发病机制中的作用［13］。

1.4 多系统萎缩模型的研究进展 多系统萎缩实验模型的发展过程是对该变性疾病病理特征不断认识理解的过程。目前对多系统萎缩的症状治疗效果有限且短暂，且缺少有效改善病情的治疗措施。这些模型较完美地概括了多系统萎缩疾病的所有特征，也为评估治疗措施是否有效提供了条件。我们将首先描述以神经毒素为基础的多系统萎缩模型，这种模型已经在啮齿动物和非人类灵长类动物上获得了成功。为了复制出人体发病时出现的对左旋多巴反应迟钝的帕金森样症状，研究者采用立体定位注射神经毒素或系统注射神经毒素的方式，使脑组织中双侧纹状体-黑质轴同时或顺序受到损伤从而得到了具有帕金森症状样(SND)改变的模型。然后我们将回顾一下用于研究由少突胶质细胞和神经功能障碍引起的神经退行性病变潜在机制的病因学模型(将人的α-突触核蛋白在少突胶质细胞内进行表达所得到的具有GCI病理表现的模型)。最后将介绍一个目前最为完善的模型-DUAL-HIT多系统萎缩模型。

2 动物模型

2.1 立体定位鼠模型 在多系统萎缩中，帕金森综合征发病率为90%，主要表现为运动障碍，且对多巴胺能药物反应迟钝或仅暂时有效。毒物模型初步复制出多系统萎缩中帕金森综合征对左旋多巴反应迟钝的病变特征。神经毒素通过诱导纹状体和黑质两个部位的神经元同时或序贯发生变性，从而构造帕金森综合征和亨廷顿氏舞蹈病的动物模型。这种使用两种神经毒素诱导黑质和纹状体的神经元变性的“双毒双损”法已经通过大鼠试验实现。如将6-OHDA和QA(喹啉酸)分别注射在前脑内侧束(MFB)和纹状体3～4w，可通过药物诱导双损害使动物失去转棒行为的能力［14］。为了探究纹状体和黑质受损顺序对模型的影响，随后的一项研究评估了先在纹状体注射QA后在MFB注射6-OHDA和先在MFB注射6-OHDA后在纹状体注射QA两种情况下模型动物的行为学改变程度。在纹状体先注射6-OHAD可以减少QA神经毒素的作用，而在纹状体受损前先注射QA则不会影响6-OHAD的神经毒素的作用。行为学上，在双损的动物模型观察到了双侧运动障碍［15］。由于在顺序给药的双毒双损的鼠模型中，发现了多巴胺能损耗，所以在纹状体内同时注射6-OHDA和QA，试图减少神经元的易损性，但是结果表明该方法加剧了QA对纹状体的损伤而并没有减少降低6-OHDA对多巴胺能的损耗，并发现此模型大鼠行为学上的转棒能力的下降和同侧肢体运动障碍［16］。

为了避免双毒双损模型中两个受累部位之间的相互作用的影响和黑质首先受累导致的保护效应，研究者提出了“单毒双损”模型的构想。在此过程中，于纹状体内注射一个单独的神经毒素药物，从而诱导纹状体和黑质神经元联合变性。这个神经毒素采用琥珀酸脱氢酶抑制剂3-NP或呼吸链的复合物Ⅰ抑制剂MPP+［17］。3-NP和MPP+均可诱导双侧运动障碍以及黑质神经元缺失达到大于40%，纹状体神经元缺失47%(MPP+)和76%(3-NP)。所有的立体定位大鼠模型都可以复制出对多巴胺反应迟钝的运动障碍现象，并可表现出安非他明或阿朴吗啡诱导的旋转现象。纹状体变性受损不仅可以抑制多巴胺药物的行为反应，还可以加重感觉运动障碍。黑质和纹状体的联合变性不仅仅导致症状简单的叠加，而且导致了一种特定的运动疾病。此外，减少纹状体介质棘神经细胞的脆性后，研究者观察到多巴胺能神经损伤是一种积极的纹状体神经退化调节器［18］。基于研究结果和不同的模型，估计约25%的纹状体变性就可以导致多巴胺能反应消失，导致严重的行为恶化表现［19］。立体定位鼠模型的主要优势是获取各种程度的黑质纹状体变性可能性，从而复制出MSA神经病理学的各方面表现，从早期到最经典期。然而这种模型的局限性是它只概括了MSA神经病理学和全部特征的一部分，不能复制出广泛的基底神经节病变。此外，它能被用以评估非多巴胺类药物抗帕金森病作用的潜力尚未被充分地挖掘。

2.2 系统毒物模型 研究证明可通过全身给予神经毒素的方法，在亚急性和慢性中毒过程中诱导神经元逐渐缺失或变性。该动态性的方法将人类神经变性疾病中的时间因素考虑进去了。系统性毒物模型通过使用腹腔注射和静脉给予MPTP和3-NP来处理小鼠和非人类灵长类动物的方法，重建出了多系统萎缩中纹状体-黑质变性的神经病理学特征。在非人类灵长类动物实验中，用MPTP处理过的猴长期服用3-NP引发逐渐加重的帕金森病样症状，并且引起猴的后肢肌张力障碍和纹状体变性及多巴胺反应消失，从而进一步加剧猴的运动障碍，但却缓解了由MPTP作用导致的丘脑底核神经元异常放电的现象［20］。在小鼠体内全身给3-NP可以诱导一个明显的运动障碍综合征(后肢肌张力障碍和夹紧、姿势调节障碍)，这与纹状体侧部的神经元变性和一些多巴胺能神经元缺失有关［21］。研究发现，序贯性给予3-NP和MPTP(先MPTP后3-NP或先3-NP后MPTP)都可以使纹状体和黑质的神经元显著缺失，但MPTP和3-NP顺序给药可以互相削减对方的毒性作用，如MPTP可以减轻3-NP对纹状体神经元的损伤，而3-NP可以减轻MPTP对黑质多巴胺能神经元的损伤。使用序贯性给药方案时，3-NP可以使其行为学障碍更突出，主要表现为自主活动能力减少，这与纹状体DARPP-32神经元缺失有关［22］。将3-NP和MPTP联合给药超过9d与单独使用MPTP或3-NP相比，不仅感觉运动表现有所改变，且运动障碍程度明显加重，症状持续时间也明显延长，纹状体损伤也显著增加(神经元缺失和星型胶质细胞增生)［23］。和立体定位大鼠模型相似，系统模型复制的病理学特点依旧限制在纹状体-黑质系统。然而，这些模型为DUAL-HIT模型的建立和发展奠定了基础。

2.3 转基因模型 少突胶质细胞中α-突触核蛋白的鉴别和随后将MSA看做是一种突触核蛋白疾病的做法为该病的研究提供了病理生理学基础。几种利用少突胶质细胞中特定启动子控制表达人野生型α-突触核蛋白的转基因小鼠模型因此被创建出来。在少突胶质细胞中目的性表达人的野生型α-突触核蛋白是在脂蛋白(PLP)启动子［24］、髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子［25］或者 2’，3’-环腺苷酸 3’-磷酸二酯酶(CNP)启动子［26］的控制下实现的。这3种转基因品系都重现了少突胶质细胞中不溶性突触核蛋白累积。此外，在PLP和MBP启动子控制下表达的SYN表现出129位丝氨酸的过磷酸化［25］。3种品系的小鼠都显示出不同程度的运动损害，例如滚筒测试表现的接连退步、滚筒测试和爬杆测试的表现变差或者后肢步幅减小。非运动症状也可能存在，例如在MBP启动子的模型中发现有小鼠的嗅觉退化［27］。神经病理学显示在3种小鼠中都存在少突胶质细胞过表达SYN导致各种超微结构和形态学的改变，包括髓鞘缺失和轴突退化。另在PLP启动子模型中发现中度的黑质多巴胺能神经元缺失［28］，而MBP启动子的模型中有黑质多巴胺能神经元、纹状体酪氨酸羟化酶阳性神经元和纹状体神经元的缺失［29］。而3种转基因模型中均没有发现小脑和脑桥核团自发的神经元损失。从应用MBP启动子的转基因小鼠几个世系的传代中获得的结果强烈地表明少突胶质细胞表达SYN的程度对于行为和病理结果有显著的影响［25］。尚无研究直接证明3种品系小鼠之间的病理改变的不同与基因量的不同相关。如果少突胶质细胞表达SYN的量对于行为学损害和神经退行性病变是关键的话，那么杂交两种品系的转基因小鼠是增强损害和退行的一个简单方法。MBP启动子控制的SYN过表达也被发现能够调节多种神经营养因子的表达，例如胰岛素样生长因子1和胶质源性神经生长因子，因此这提示我们，少突胶质细胞中神经营养因子的供应减少是疾病发展的一个关键因素［27］。另外，最近有证据表明少突胶质细胞表达SYN也能够重现某些与自主节律有关的脑干核团的退化［30］。然而，自主节律的损伤还没有在几种MSA的转基因模型小鼠中发现。基因模型在重现MSA的少突胶质细胞标志性特点方面有巨大优势，并且该模型已经被证明在阐明与少突胶质细胞积累SYN有关的病理机制方面富有价值。然而，这种模型的神经退行范围与人类MSA相比还是很有限的。既然这些模型是基于少突胶质细胞中SYN的组成型表达，那么它们在成年个体中的条件型表达能否更好地重现人类疾病还有待讨论。

2.4 DUAL-HIT模型 上述所有的模型都有其局限性，以毒素作为基础的模型诠释了纹状体-黑质系统神经元缺失的形式和程度，但是并没有成功复制出基底节区以外的病变，也没有复制出α-突触核蛋白在少突胶质细胞内异常积聚的典型病理表现。另一方面，转基因模型成功复制出了α-突触核蛋白在少突胶质细胞内异常积聚，但是该模型并没有诠释发生在人类疾病中的神经变性疾病的所有表现形式。为了克服这些限制，研究者以用3-NP诱导的系统模型为基础，并将其应用在具有人类野生型α-突触核蛋白在少突胶质细胞表达的转基因模型上。使用3-NP处理由蛋白脂质-蛋白启动子操控的、表达人野生型α-突触核蛋白的转基因小鼠，可以引起黑质-纹状体和脑桥-橄榄核-小脑系统广泛的神经元退行性变，并增强了运动障碍的程度［28］。用3-NP处理由MRP启动子操控的、表达人野生型α-突触核蛋白的转基因小鼠增加了α-突触核蛋白的氧化修饰，使其运动障碍程度和神经元退行性改变加剧［29］。因此DUAL-HIT模型是一个集系统模型和转基因模型优点于一体的模型。该模型可以描述MSA所有临床表现和α-突触核蛋白积聚在少突胶质细胞的典型病理改变。DUAL-HIT模型是目前最新、最完美的MSA动物实验模型。

3 总结

尽管以毒素和基因为基础的模型存在一定局限性，但是在过去的15年中，通过对多系统萎缩的实验性研究取得的进展使我们对这种破坏性疾病的认识有了显著性的进步。以毒素为基础的模型对分析基底节病变导致的对左旋多巴反应迟钝的帕金森样症状非常有价值，有助于有效地评估非多巴胺药物减轻运动症状的潜在作用。以基因为基础的模型具有很好的病因学有效性，对研究少突胶质细胞的产生及其如何促进神经元变性有重要价值，这些将有益于探讨遗传易感性与环境因素的共同作用。此外以基因为基础的模型将作为疾病机制研究的最好平台，并且已经有越来越多的临床实验证明，疾病的研究已经开始从实验室转向临床实践。尽管如此，目前仍有很多问题尚未解决，例如能用于减少多系统萎缩引起的运动障碍和自主神经症状的治疗方案就非常有限。所以无论是实验室动物研究还是临床实践，我们需要阐明多系统萎缩的发病机制，从根本上解决该病的治疗及预防。

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