星形胶质细胞与脑水肿的形成

邓江山综述， 赵玉武审校

星形胶质细胞在哺乳动物脑内是神经元数量的5倍，参与了营养代谢、脑内离子和水平衡、脑血流量和突触传递的调节、血脑屏障正常功能的维持、胶质瘢痕修复和灰白质发育［1，2］。星形胶质细胞足突，脑血管内皮细胞以及相邻内皮细胞之间的紧密连接，周围细胞和基质一起构成了血脑屏障。除了与脑微血管密切的接触，星形胶质细胞大量的突起包绕在突触周围以及延伸到脑室腔表面形成胶质界膜，共同构成了对脑内液体调节的结构基础。脑内液体在脑血管腔、细胞间隙和脑细胞内不停交换，若在脑内代谢失衡，过度积聚即可能发生脑水肿。星形胶质细胞上存在大量水通道蛋白，离子通道和转运体，现就其参与脑内水、离子代谢及脑水肿形成方面简要综述。

1 与转移水有关的生物学基础

1.1 谷氨酸转运体 神经突触传递使得突触间隙谷氨酸浓度升高，星形胶质细胞发挥主要清除作用，以保证正常神经活动进行。星形胶质细胞膜上含有两种高亲和力转运体(excitatory amino acid transporter1，EAAT1)和 EAAT2(excitatory amino acid transporter2，EAAT2)。EAAT1转移水基本是等渗转运，对细胞内渗透压影响不大，但神经细胞摄取过多的谷氨酸并伴随水的进入能引发细胞体积增大。另一方面，谷氨酸浓度过高时激活谷氨酸促代谢性受体，引发细胞水肿，其机制为细胞内钙库钙释放，激活钙调蛋白激酶和一氧化氮合酶，通过蛋白激酶G途径使得水通道蛋白-4(aquaporin-4，AQP4)发生磷酸化，增加AQP4对水的通透性［3］。不同部位的星形胶质细胞对谷氨酸诱发肿胀反应不一，发现大脑皮质和海马较小脑相对容易发生兴奋性氨基酸毒性水肿，可能是因为脑内各部位谷氨酸转运体及AQP4分布不一致引起［4］。

1.2 离子通道

1.2.1 钾通道 K+平衡电位为细胞膜静息电位主要组成部分，复极化后细胞外过高的K+需要迅速被清除，星形胶质细胞不断摄取K+通过缝隙连接网络缓冲细胞外K+浓度以保证神经元活动正常进行［5］。Kir4.1是星形胶质细胞膜上已发现5种钾通道中最主要的一种，转移钾具有双向性，能根据细胞内外钾离子浓度差来摄取或排出钾。其主要位于星形胶质细胞包绕在突触、血管周围和软脑膜下的足突上面。K+的吸收伴有水的进入，水的进入主要通过AQP4［6］。

1.2.2 NKCC NKCC(Na+/K+/CL-)同向转运体单向协同转运1Na+、1K+、2CL-，有两种亚型，NKCC1 和 NKCC2。其中NKCC2仅存在于肾脏，NKCC1分布于多种细胞包括星形胶质细胞和神经元，转移离子的同时伴随水的转移。在脑缺血和脑创伤中，当K+浓度很高时，此时单纯钾通道不足以转移过多的钾离子，NKCC通道被激活。当星形胶质细胞上各种钾通道发挥“缓冲钾”作用时，大量K+进入细胞，细胞内离子浓度升高导致渗透性水转移引起细胞体积增大。据报道，谷氨酸能增加NKCC1活性，导致细胞肿胀［7］。

1.2.3 体积调节性阴离子通道(volume regulated anion channels，VRACs) 目前尚不清楚VRACs是单独的一种离子通道，还是不同离子通道的复合体。在低渗环境中培养的星形胶质细胞发生形态变化，细胞体积增大激活VRACs，激活后除了排除CL-，还释放兴奋性氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸、牛磺酸、ATP［8］。细胞内溶质的排出有利于细胞渗透压恢复平衡和细胞体积回到正常。AQP4基因敲除大鼠VRACs表达量下调，提示血管周围星形胶质细胞足突膜上水通道和离子通道之间存在密切作用，共同调节脑内水平衡［9］。

1.3 AQP4 AQPs是细胞膜上的跨膜水通道蛋白，具双向水通透性，哺乳动物体内发现的13种水通道蛋白中［10］，AQP4在脑内含量最丰富，主要分布于包绕毛细血管周围的星形胶质细胞足突、室管膜细胞及室管膜下星形胶质细胞足突形成的胶质界膜上，在邻近毛细血管的足突上密度最高。AQP4本身的表达数量，在星形胶质细胞足突上的准确定位以及与离子通道、血脑屏障之间的相互作用都可以影响水的通透性［11］。

2 星形胶质细胞膜“极性”结构

星形胶质细胞膜表面的分子结构分布呈非均质性，特异性分布在靠近细胞外基质侧膜上，呈现“极性”状态。用冰冻蚀刻技术观察生理状态下软脑膜下和脑微血管旁的星形胶质细胞终足，发现在面临基质侧足突膜上存在大量“方形阵列”结构(orthogonal arrays of intramembranous particles，OAPs)。

2.1 OAPs结构基础 AQP4可能是OAPs的主要分子基础［12］，证据包括:AQP4缺乏的小鼠OAPs结构消失;AQP4转染的中国仓鼠卵巢细胞能形成OAPs结构;抗AQP4抗体标记直接覆盖了OAPs结构。由于翻译起始位置不同，AQP4包括两种亚型M1和M23，两者首先聚合成四聚体，然后再进一步排列成更高级“方形阵列”。M1单纯表达时，不能形成稳定的 OAPs结构，形成稳定的 OAPs结构需要 M23的参与［13，14］。但是Rossi认为M23也可直接由M1mRNA翻译生成，于是在单独存在M1的情况下也可形成OAPs结构［15］。在某些病理状态下，AQP4同样可以非OAPs结构形式存在于星形胶质细胞膜上，说明OAPs结构的形成需要某种内在因素的参与和维持，目前认为除了AQP0和AQP4以不同数量的四聚体构成更复杂的结构，其他的AQPs均不形成更高级结构［14］。

2.2 Agrin Agrin是一种肝素硫酸蛋白聚糖，其存在于细胞外基质中。当星形胶质细胞足突膜远离血管旁和软脑膜下基质时，OAPs结构明显减少，由此推测星形胶质细胞膜“极性”的形成可能与细胞外基质有关。Noell在存在agrin介质上培养的星形胶质细胞膜上AQP4表达量增强，形成OAPs结构，水转移能量增强［16］，敲除Agrin基因后发现小鼠星形胶质细胞足突膜上OAPs结构明显减少。体外培养无Agrin的情况下，野生型小鼠和Agrin基因敲除小鼠两种来源的星形胶质细胞膜上均不能形成OAPs，而经检测AQP4的表达量在蛋白表达水平和转录水平均无差异［17］。Fallier-Becker观察到类似的结果，通过对存在Agrin培养基上培养来自于基因敲除小鼠和野生型小鼠的星形胶质细胞，发现AQP4表达水平无差异，冰冻切片观察OAPs密度较高，同时星形胶质细胞在低渗环境下水通透性增加。以上充分说明了Agrin有利于AQP4在星形胶质细胞足突膜上聚集形成OAPs结构，从而增强转移水的能力［18］。Agrin有不同亚型，主要包括神经元型A0B0和内皮细胞型A4B8。内皮型A0B0促使AQP4形成小的集合体，神经元型A4B8使得OAPs密度在某些地方明显增加，说明两种Agrin均能促使AQP4的聚集，但是后一种效果更明显［16］。综上，从体内和体外均说明了Agrin能促进小鼠脑内AQP4形成OAPs结构。

2.3 DDC复合体 AQP4并不是以单个水通道的形式镶嵌在细胞膜上，而是与抗肌萎缩蛋白聚糖复合物(dystroglycan-dystrophin complex，DDC)连接被锚定在血管旁星形胶质细胞膜足突上［19，20］。DDC复合体在肌肉系统中研究较多，其位于肌细胞膜上，连接细胞外基质成分和肌膜，以在肌收缩过程中发挥稳定结构的作用［21］，近来也发现其在脑内发挥着重要作用。肌营养不良蛋白聚糖是DDC的重要组成部分，包括α和β两个亚基。α-dystroglycan与细胞外基质如Agrin连接;β-dystroglycan是一个跨膜蛋白，将α-dystroglycan与细胞骨架蛋白和其他胞内蛋白连接，例如dystrophin和αsyntrophin。另外，α-Dystrobrevin蛋白与dystrophin蛋白相互连接。基因敲除技术证明，在缺乏dystrophin-71或α-syntrophin大鼠，AQP4在星形胶质细胞膜足突上的“极性”分布明显减少。Nicchia观察两种dystrophin缺陷小鼠品种，DP71KO(缺乏胶质细胞dystrophin-71基因产物)和mdx3cv小鼠(所有dystrophin亚型均明显减少)，发现存在于血管旁星形胶质细胞上的AQP4“极性”分布依赖于dystrophin，而位于小脑的颗粒细胞层以及软脑膜下星形胶质细胞足突和室管膜细胞上AQP4分布不依赖于dystrophin，说明了血脑屏障与AQP4关系密切，血管旁AQP4受dystrophin调控，而脑膜下AQP4不受其调控［19］。在实验性脑脊髓炎动物模型中，观察到βdystroglycan被炎症激活的细胞外基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)清除后，OAPs结构能形成，但在星形胶质细胞足突上特异性定位被破坏［22］。另外选择性基因敲除dystroglycan基因后，血管旁和皮质浅层星形胶质细胞足突上OAPs结构大大减少，甚至血管旁足突上AQP4表达也减少［23］。α-Dystrobrevin基因敲除后，在 dystrophins蛋白存在情况下同样导致AQP4和Kir4.1分布改变而蛋白表达量不受影响，在整个膜上弥散性分布［24］。以上说明了DDC复合体中任何一种蛋白与AQP4在膜上的准确定位都非常相关。细胞外基质Agrin对AQP4形成OAPs结构有重要作用，OAPs结构主要出现在面临细胞外基质一侧足突膜上，主要是为了建立水通道的“极性”分布，有利于迅速且直接转移水。

3 星形胶质细胞与血脑屏障

血脑屏障作为脑实质和外周循环系统之间的一道弥散性屏障，通过机械屏障作用、电荷阻力和转运系统共同调节血管内和脑实质之间的物质交换。脑微血管表面大约99%以上被星形胶质细胞足突覆盖，血管内皮细胞的发育依赖于细胞周围环境。星形胶质细胞除了对血脑屏障的形成有关，对正常血脑屏障功能的维持也至关重要。足突膜上OAPs“极性”分布结构对血脑屏障完整性的维持非常重要。间接证据证明:脑胶质母细胞瘤血脑屏障紧密连接蛋白claudin-3丧失，血脑屏障遭破坏，OAPs相关的“极性”分布结构消失。当Agrin表达时，occludin、claudin-5存在，说明了在胶质母细胞瘤中 Agrin与血脑屏障损害之间存在某种相关性［25］。Zhou报道AQP4基因敲除大鼠，脑微血管结构发生改变，紧密连接破坏，血脑屏障通透性明显增加，血管旁星形胶质细胞足突肿胀［26］。但随后Saadoun报道，AQP4基因敲除大鼠未见明显脑水肿，内皮细胞间紧密连接完整，血脑屏障结构正常［27］。敲除α-Dystrobrevin后，不仅破坏星形胶质细胞足突细胞膜上分子的“极性”分布，而且发现血脑屏障被破坏［24］，则充分说明了星形胶质细胞膜上分子结构对维持血脑屏障完整性发挥重要作用。

4 星形胶质细胞与脑水肿

4.1 星形胶质细胞体积调节机制 星形胶质细胞膜上含有多种离子通道，AQP4，氨基酸转运体，摄纳大量离子和神经递质后，细胞内渗透压升高，水分伴随进入胞内，引发细胞体积生理性一过性增大，激活星形胶质细胞体积调节机制［28］。细胞体积增大激活一系列生理反应，引发细胞排出各种物质及水以恢复正常细胞体积［8，29］。参与体积调节的离子通道有 VRACs，CL-通道，Kir4.1。生理状态下，随着神经活动发生，星形胶质细胞足突表现为短暂一过性体积增大，当细胞体积调节机制受损则可能发生细胞水肿。

4.2 细胞性水肿 当脑组织发生缺氧或葡萄糖供应不足时，细胞膜Na+-K+-ATP泵因ATP供应不足发生功能障碍，正常的膜内外Na+、K+梯度不能维持，同时细胞内代谢产物不能排除，导致细胞内物质聚集，渗透压增高，水分由于渗透梯度进入细胞内引起细胞肿胀。与神经元相比，星形胶质细胞负责摄取细胞外K+和谷氨酸，细胞内渗透压更容易增高，因此发生细胞性脑水肿时，星形胶质细胞足突肿胀往往为早期主要表现［30］。AQP4基因敲除可以延缓早期局灶性脑缺血、细菌性脑膜炎脑水肿形成。同样，转基因小鼠过度表达AQP4，可以加速水中毒性脑水肿的发生［31］。上述AQP4在细胞膜上的一些连接蛋白，同样影响到AQP4的水通透性。敲除α-syntrophin大鼠由于AQP4不能很好锚定在足突膜上，可以延缓脑缺血脑水肿的发生［32］。在Agrin基因敲除大鼠，AQP4“极性”分布消失，细胞内水肿延迟发生［33］，说明了星形胶质细胞足突膜上分子“极性”分布方式确实与细胞性脑水肿有关。

4.3 血管性脑水肿 血管性脑水肿的发生是因为血脑屏障被破坏引起，包括脑出血、感染、肿瘤等。

实验表明众多MMPs参与破坏了血脑屏障，导致血管性脑水肿的发生。星形胶质细胞足突主要表达MMP-2及其激活剂MT1-MMP。自发性高血压大鼠大脑中动脉阻塞后，MMP-9在24h后生成和MMP2在第5天明显增加，均与脑水肿的发展相一致［34］。在缺血再灌注模型中，梨状皮质血脑屏障再灌注3h后发生开放，同时MMP-2及其激活剂MT1-MMP一过性增加［35］，而claudin-5和occludin在恢复灌注3h后减少，24h后完全消失，如果予以MMPs抑制剂能消除这种效应［36］，充分说明了MMPs与血脑屏障破坏引起脑水肿之间的密切关系。水肿液的清除主要经脑脊液循环通路，经过内皮细胞返回血液和经过淋巴系统进入血液循环［37］，水肿液经室管膜细胞和星形胶质细胞界膜上的AQP4进入脑室腔为主要清除途径。在众多血管性脑水肿模型中，AQP4基因敲除小鼠较野生型小鼠脑水肿更加严重，说明了AQP4缺乏可能引起了水肿清除障碍。另外，星形胶质细胞能清除细胞外水肿液中的血清蛋白，加速水肿液的吸收。

5 结语和展望

人们认识到星形胶质细胞与脑微血管、神经元的密切关系，于是提出“神经血管单元”的概念，其在中枢神经活动中发挥重要作用，尤其与脑内微环境动态平衡密切相关。星形胶质细胞与脑水肿关系毋庸置疑。脑水肿进展快，危害性大，做到有效控制必须进一步研究其发病环节。个人认为:星形胶质细胞对水的转移的影响最终归结于AQP4的通透性变化，AQP4与水转移之间的关系已经很明确，对其调节因素和相关作用蛋白研究需要进一步深入;神经血管单元组分之间存在相互作用，研究其组分之间的相互作用及其信号机制，有利于在脑水肿不同发展阶段做到有效调控。

［1］Nag S.Morphology and properties of astrocytes［J］.MethodsMol Biol，2011，686:69-100.

［2］Sofroniew MV，Vinters HV.Astrocytes:biology and pathology［J］.Acta Neuropathol，2010，119(1):7-35.

［3］Gunnarson E，Zelenina M，Axehult G，et al.Identification of a molecular target for glutamate regulation of astrocyte water permeability［J］.Glia，2008，56(6):587-596.

［4］Han BC，Koh SB，Lee EY，et al.Regional difference of glutamate-induced swelling in cultured rat brain astrocytes［J］.Life Sci，2004，76(5):573-583.

［5］Rash JE.Molecular disruptions of the panglial syncytium block potassium siphoning and axonal saltatory conduction:pertinence to neuromyelitis optica and other demyelinating diseases of the central nervous system［J］.Neuroscience，2010，168(4):982-1008.

［6］MacAulay N，Zeuthen T.Water transport between CNScompartments:contributions of aquaporins and cotransporters［J］.Neuroscience，2010，168(4):941-956.

［7］KoyamaY.Transient treatments with L-glutamate and threo-betahydroxyaspartate induce swelling of rat cultured astrocytes［J］.Neurochem Int，2000，36(2):167-173.

［8］Pasantes-Morales H，Cruz-Rangel S.Brain volume regulation:osmolytes and aquaporin perspectives［J］.Neuroscience，2010，168(4):871-884.

［9］Benfenati V，Nicchia GP，Svelto M，et al.Functional down-regulation of volume-regulated anion channels in AQP4 knockdown cultured rat cortical astrocytes［J］.J Neurochem，2007，100(1):87-104.

［10］Zelenina M.Regulation of brain aquaporins［J］.Neurochem Int，2010，57(4):468-488.

［11］Wolburg H，Noell S，Mack A，et al.Brain endothelial cells and the glio-vascular complex［J］.Cell Tissue Res，2009，335(1):75-96.

［12］Wolburg H，Wolburg-Buchholz K，Fallier-Becker P，et al.Structure and functions of aquaporin-4-based orthogonal arrays of particles［J］.Int Rev Cell Mol Biol，2011，287:1-41.

［13］Furman CS，Gorelick-Feldman DA，Davidson KG，et al.Aquaporin-4 square array assembly:opposing actions of M1 and M23 isoforms［J］.Proc Natl Acad Sci U SA，2003，100(23):13609-13614.

［14］Nicchia GP.Higher order structure of aquaporin-4［J］.Neuroscience，2010，168(4):903-914.

［15］Rossi A，Pisani F，Nicchia GP，et al.Evidences for a leaky scanning mechanism for the synthesis of the shorter M23 protein isoform of aquaporin-4:implication in orthogonal array formation and neuromyelitis optica antibody interaction ［J］.J Biol Chem，2010，285(7):4562-4569.

［16］Noell S，Fallier-Becker P，Beyer C，et al.Effects of agrin on the expression and distribution of the water channel protein aquaporin-4 and volume regulation in cultured astrocytes［J］.Eur J Neurosci，2007，26(8):2109-2118.

［17］Noell S，Fallier-Becker P，Deutsch U，et al.Agrin defines polarized distribution of orthogonal arrays of particles in astrocytes［J］.Cell Tissue Res，2009，337(2):185-195.

［18］Fallier-Becker P，Sperveslage J，Wolburg H，et al.The impact of agrin on the formation of orthogonal arraysof particles in cultured astrocytes from wild-type and agrin-null mice［J］.Brain Res，2011，1367:2-12.

［19］Nicchia GP，Rossi A，Nudel U，et al.Dystrophin-dependent and-independent AQP4 pools are expressed in the mouse brain［J］.Glia，2008，56(8):869-876.

［20］Nicchia GP，Cogotzi L，Rossi A，et al.Expression of multiple AQP4 pools in the plasma membrane and their association with the dystrophin complex［J］.J Neurochem，2008，105(6):2156-2165.

［21］Ehmsen J，Poon E，Davies K.The dystrophin-associated protein complex［J］.JCell Sci，2002，115(Pt 14):2801-2803.

［22］Wolburg-Buchholz K，Mack AF，Steiner E，et al.Loss of astrocyte polarity marks blood-brain barrier impairment during experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.Acta Neuropathol，2009，118(2):219-233.

［23］Noell S，Wolburg-Buchholz K，Mack AF，et al.Evidence for a role of dystroglycan regulating the membrane architecture of astroglial endfeet［J］.Eur JNeurosci，2011，33(12):2179-2186.

［24］Lien CF，Mohanta SK，Frontczak-Baniewicz M，et al.Absence of glial alpha-dystrobrevin causes abnormalities of the blood-brain barrier and progressive brain edema［J］.J Biol Chem，2012，287(49):41374-41385.

［25］Rascher G，Fischmann A，Kroger S，et al.Extracellular matrix and the blood-brain barrier in glioblastoma multiforme:spatial segregation of tenascin and agrin［J］.Acta Neuropathol，2002，104(1):85-91.

［26］Zhou J，Kong H，Hua X，et al.Altered blood-brain barrier integrity in adult aquaporin-4 knockout mice［J］.Neuroreport，2008，19(1):1-5.

［27］Saadoun S，Tait MJ，Reza A，et al.AQP4 gene deletion in mice does not alter blood-brain barrier integrity or brain morphology［J］.Neuroscience，2009，161(3):764-772.

［28］Kimelberg HK.Astrocytic swelling in cerebral ischemia as a possible cause of injury and target for therapy［J］.Glia，2005，50(4):389-397.

［29］Verbalis JG.Brain volume regulation in response to changes in osmolality［J］.Neuroscience，2010，168(4):862-870.

［30］Nase G，Helm PJ，Enger R，et al.Water entry into astrocytes during brain edema formation［J］.Glia，2008，56(8):895-902.

［31］Yang B，Zador Z，Verkman AS.Glial cell aquaporin-4 overexpression in transgenic mice accelerates cytotoxic brain swelling ［J］.J Biol Chem，2008，283(22):15280-15286.

［32］Amiry-Moghaddam M，Otsuka T，Hurn PD，et al.An alpha-syntrophin-dependent pool of AQP4 in astroglial end-feet confers bidirectional water flow between blood and brain［J］.Proc Natl Acad Sci U SA，2003，100(4):2106-2111.

［33］Steiner E，Enzmann GU，Lin S，et al.Loss of astrocyte polarization upon transient focal brain ischemia as a possible mechanism to counteract early edema formation［J］.Glia，2012，60(11):1646-1659.

［34］Rosenberg GA，Navratil M，Barone F，et al.Proteolytic cascade enzymes increase in focal cerebral ischemia in rat［J］.J Cereb Blood Flow Metab，1996，16(3):360-366.

［35］Chang DI，Hosomi N，Lucero J，et al.Activation systems for latent matrix metalloproteinase-2 are upregulated immediately after focal cerebral ischemia［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2003，23(12):1408-1419.

［36］Yang Y，Estrada EY，Thompson JF，et al.Matrix metalloproteinase-mediated disruption of tight junction proteins in cerebral vessels is reversed by synthetic matrix metalloproteinase inhibitor in focal ischemia in rat［J］.JCereb Blood Flow Metab，2007，27(4):697-709.

［37］Nag S，Manias JL，Stewart DJ.Pathology and new players in the pathogenesis of brain edema［J］.Acta Neuropathol，2009，118(2):197-217.