大鼠颞叶癫痫点燃后海马zif268mRNA及其蛋白的时空表达变化

李春女， 李 淞， 李秀杰， 张淑琴， 梁建民

致癫过程包括分子、细胞和神经元网络的级联变化［1］:神经元网络早期急性损害在最初数分钟至数天出现，包括神经细胞膜除极引起的离子通道动力学快速变化、功能蛋白的翻译后修饰和即早基因(immediate early gene，IEGs)活化;在数小时至数周出现的亚急性反应包括转录事件、神经元死亡和炎症级联反应;在数周至数月出现的慢性反应主要包括解剖学改变:如神经发生、苔藓纤维发芽、神经网络重建和胶质增生。IEGs编码蛋白作为神经细胞表面受体、胞质第二信使系统和核内特异靶基因间胞内信号转导的第三信使，可作为转录因子上调或下调中枢神经系统效应基因表达。因此，IEGs被喻为神经元短期兴奋性转变为长期癫痫表型的分子开关［2］，此外，IEGs也是癫痫后神经元凋亡的重要调控因子之一［3］。zif268(也称为 Egr-1、NGFI-A 或Krox 24)由Milbrandt于1987年首先克隆发现的一种IEGs［4］。zif268与长期记忆、空间记忆能力的巩固密切相关［5］，可能是调节记忆相关蛋白合成的关键因子，也可能参与癫痫病理过程［6，7］。我们过去发现颞叶癫痫大鼠存在空间记忆损害［8］，本研究探讨海马zif268时空表达与颞叶癫痫脑损伤的关系。

1 材料和方法

1.1 实验材料 健康雄性Wistar大鼠83只，体重约250g，月龄约2.5月，购于本校实验动物部。试剂:KA和DEPC(美国Sigma公司)、多聚甲醛(北京化学试剂公司)、zif268mRNA原位杂交试剂盒和Zif268免疫组织化学试剂盒(美国 Santa cruz公司)。仪器:立体定位仪(美国)、HPIAS-1000高清晰彩色病理图像分析系统(日本)。

1.2 动物分组 Wistar大鼠83只，麻醉死亡2只，点燃后抽搐死亡3只，最终参与实验78只，包括正常组6只，Sham组和TLE组各36只。后两组按点燃或假手术后 6h、24h、72h、7d、14d、21d 时间点分为6小组，每小组6只。

1.3 颞叶癫痫模型建立 按以往方法［8］，在立体定位仪下，采用KA杏仁核微量注射方法建立大鼠颞叶癫痫点燃模型。按Racine分级标准将大鼠癫痫发作分为0～Ⅴ级［9］，大鼠出现Ⅳ级或以上发作者为点燃成功。假手术组杏仁核注射与KA等体积的PBS缓冲液。

1.4 石蜡切片标本制备 分别于点燃或假手术后6h、24h、72h 和 7d、14d、21d 再次麻醉大鼠，经4%多聚甲醛液心脏灌注固定后取脑，以视交叉后4mm和8mm处行冠状切片，片厚4mm，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，切成5μm厚连续冠状切片。

1.5 原位杂交检测 原位杂交过程按zif268mRNA原位杂交试剂盒说明书操作:主要步骤为切片脱蜡、二甲苯和梯度乙醇处理后用0.01%曲拉通X-100溶液浸泡，用3%H2O2去除内源性过氧化物酶，复合消化液暴露mRNA片段，预杂交，杂交，切片，IgG封闭和阻断，滴加生物素化抗地高辛抗体;滴加高敏TSP(ZYMED)SABC过氧化物酶复合物，DAB剂显色，苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片后光镜观察，阳性表达细胞被染成棕黄色。

1.6 免疫组织化学检测 Zif268蛋白表达采用免疫组织化学ABC法，用生物素标记的第二抗体与链霉亲和素蛋白连接的过氧化酶及基质混合液的反应来测定细胞中的抗原，按试剂盒说明进行:包括切片脱蜡、二甲苯和梯度乙醇处理后用0.01%曲拉通X-100溶液浸泡，用3%H2O2处理，正常山羊血清封闭后，滴加特异性第一抗体，37℃湿盒孵育2h，内源性生物素封闭和阻断，滴加特异性生物素化第二抗体，37℃湿盒孵育50min，DAB显色5min，苏木素复染，封片，光镜观察。每次染色均以PBS代替第一抗体作为阴性对照。

1.7 图像分析和统计学处理 在200倍放大显微镜下，zif268mRNA表达主要在神经元胞质出现棕褐色颗粒物质，Zif268蛋白表达主要在神经元胞核显棕色。在每只大鼠海马CA1、CA3和DG区随机各选择5个不重叠视野，双盲法统计zif268mRNA或Zif268蛋白表达阳性细胞数的均值分别记为每只大鼠海马相应区域zif268mRNA或Zif268蛋白的表达量，结果以均数±标准差(χ±s)表示，记录后绘制统计图。应用SPSS 13.0软件单因素方差分析和Logistic回归分析进行数据处理，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学观察 KA注射后平均50min左右大鼠出现癫痫发作，最初表现为凝视、颤动、点头等部分性发作动作，随后出现Racine IV级或以上发作，以前肢痉挛旋转、站立倾倒和四肢抽搐等为主，部分出现癫痫持续状态。假手术组未见癫痫发作。

2.2 点燃成功率 参与点燃大鼠共41只，麻醉死亡2只，抽搐出现呼吸抑制死亡3只，点燃成功率为87.8%。假手术组36只无死亡者。

2.3 海马各区或各时间点zif268mRNA表达

正常组和Sham组海马各区总体阳性细胞表达率(positive cell count，PCC)无差异(P ＞0.05)，组内比较均为 DG表达高于 CA1和 CA3区(P＜0.05)。TLE组海马各区均高于Sham组(P＜0.05)，与正常组和Sham组不同，组内不同区域表达无差异(P＞0.05);TLE组在点燃后24h海马zif268mRNA出现表达高峰，7d最低，在14d和21d有所回升;点燃后6h、24h、14d、和 21d 高于 Sham 组(P ＜ 0.05);在21d海马各区zif268mRNA表达均高于Sham组(P＜0.05)。Logistic回归分析显示海马 zif268mRNA阳性细胞表达率与颞叶癫痫呈正相关(β=0.286，P＜0.001)。

2.4 海马各区或各时间点Zif268蛋白表达正常组和Sham组海马各区总体阳性细胞表达率无差异(P＞0.05)，组内比较均以 DG表达高于CA1和CA3区(P＜0.05)，与 zif268mRNA表达一致。TLE组与zif268mRNA表达不一致，组内比较，DG表达高于CA1区(P＜0.05)，与CA3区无差异(P＞0.05)，组间比较，DG表达低于 Sham组(P＜0.05);TLE组在点燃后6h海马Zif268蛋白表达出现高峰，随后降低，在14d升高，在21d再次降低;在点燃后24h和7d低于Sham组(P＜0.05)，在14d高于Sham组(P＜0.05);在21d海马CA1和CA3区均高于Sham组(P＜0.05)，DG表达与与zif268mRNA表达不一致，低于Sham组(P＜0.05)。Logistic回归分析显示海马Zif268蛋白阳性细胞表达率与颞叶癫痫呈负相关(β =-0.153，P ＜0.001)。

3 讨论

与癫痫相关的神经细胞基因表达变化分为早期反应和后期反应，早期反应基因为即早基因(IEGs)，通常编码转录因子作为第三信使调节后期反应基因的表达，引起长期慢性表型改变，最终可能导致癫痫的产生和反复发作。研究表明，几乎所有惊厥活动均可引起边缘系统神经元IEGs动态表达变化，也包括非边缘系统，如皮层、纹状体和丘脑［1］，此外，许多IEGs参与调节癫痫后海马神经细胞的损伤与抗损伤过程［3］。可见，IEGs活化是致癫过程的重要环节之一［2］。

zif268是一种活性诱导依赖性表达的IEGs，是Egr家族成员，编码82kDa或88kDa的Zif268蛋白，胞浆中的Zif268可被激活为转录因子ZIF268而移至胞核，ZIF268具有3个连续的锌指结构，与调节序列 GCGC-TGGGCG结合，调控效应基因的转录［4］。目前认为突触长时程增强效应(long term potentiation，LTP)构成了学习记忆的生理基础，Zif268蛋白是LTP维持阶段的必须成分，Zif268缺陷则引起晚相LTP消失，24h后记忆丧失［10］。Zif268失活小鼠会出现记忆缺失［11］。最近的研究表明，Zif268是背侧海马记忆重现的再巩固过程的必需要素［12］。因此，Zif268可能是调控记忆相关蛋白表达的关键转录因子。研究发现，Zif268不仅调节记忆功能，也参与癫痫后神经元的病理损伤过程。戊四唑致痫大鼠海马zif268mRNA表达增高［6］;电压依赖型T型Ca(V)3.2通道与失神癫痫关系密切，Zif268可直接作用于Ca(V)3.2通道基因启动子区，促进其转录［13］;Liang等在运动皮层注射破伤风毒素诱导的大鼠慢性局灶型癫痫，发现Zif268表达在注射点增高，在注射点周围降低，推测Zif268可能对产生和维持局灶型癫痫起重要作用［7］。由于颞叶难治性癫痫Zif268相关报道极少，本研究采用KA杏仁核点燃成功建立了经典的颞叶难治性癫痫大鼠模型［8］，并动态观察了海马 zif268mRNA及其蛋白的时空表达。

本研究表明，正常海马各区zif268mRNA表达不完全一致，DG表达高于CA1和CA3区，Sham组与正常组海马zif268mRNA区域分布无明显差异，癫痫组海马 CA1、CA3和DG区表达较Sham组增高。颞叶癫痫点燃后zif268mRNA表达的早期峰值、波动幅度和晚期表达均高于假手术组。Honkaniemi 等 报 道［14］，KA 点 燃 后 可 快 速 诱 导zif268mRNA在海马、皮质、杏仁核表达增高，多数脑区24h开始逐渐降低至基础水平，但在CA1、CA3仍保持相对高水平，与本研究结果不完全一致。本研究发现，颞叶癫痫点燃后远期海马Zif268蛋白在海马DG存在区域性表达降低，提示颞叶癫痫点燃后远期海马DG可能存在Zif268蛋白翻译效率降低或蛋白稳定性降低等蛋白合成紊乱现象，可能与神经元死亡有关［14］。形态学资料已经证实癫痫存在苔藓纤维(mossy fiber，MF)发芽，并与癫痫的形成及其可塑性的建立密切相关。多数学者认为，CA3区神经元丢失导致DG颗粒细胞与自身胞体产生回返性突触联系是MF发芽的主要机制。在本研究中，癫痫组21d海马DG区zif268mRNA与其蛋白表达偏离，提示DG区可能存在较为长期的蛋白合成紊乱、较为严重的神经元损伤和较少的神经元再生，神经修复机制可能被过度激活，可能是海马MF发芽的病理基础或反映。回归分析提示颞叶癫痫与海马zif268mRNA表达呈正相关，与Zif268蛋白表达呈负相关，提示海马即早基因zif268及其蛋白的时空表达变化可能参与KA点燃颞叶癫痫病理过程。

总之，颞叶癫痫的发病机制可能是一系列生物学事件级联结果，其中IEGs表达是其中的重要环节之一。我们过去研究发现，颞叶癫痫大鼠存在空间记忆能力损害［8］，推测海马zif268及其蛋白时空表达改变可能是颞叶癫痫记忆损害的途径之一，还有待进一步研究。

［1］Kiessling M，Gass P.Immediate early gene expression in experimental epilepsy［J］.Brain Pathol，1993，3(4):381-393.

［2］Rakhade SN，Jensen FE.Epileptogenesis in the immature brain:e merging mechanisms［J］.Nat Rev Neurol，2009，5(7):380-391.

［3］Yount GL，Ponsalle P，White JD.Pentylenetetrazole-induced seizures stimulate transcription of early and late response genes［J］.Brain Res Mol Brain Res，1994，21(3 ～4):219-224.

［4］Milbrandt J.A nerve growth factor-induced gene encodes a possible transcriptional regulatory factor［J］.Science，1987，238(4828):797-799.

［5］Bozon B，Kelly A，Josselyn SA，et al.MAPK，CREBand zif268 are all required for the consolidation of recognition memory［J］.Philos Trans R Soc Long B Biol Sci，2003，358(1432):805-814.

［6］Pollard H，Guilhem D，Moreau J，et al.Decreased pentylenetetrazolinduced expression of zif/268 in NGF-transgenic mice［J］.Neuroreport，1994，5(17):2246-2248.

［7］Liang F，Jones EG.Zif268 and Fos-like immunoreactivity in tetanus toxin-induced epilepsy:reciprocal changes in the epileptic focus and the surround［J］.Brain Res，1997，778(2):281-292.

［8］梁建民，崔新明，李艳茹，等.颞叶癫痫大鼠海马CA1区突触可塑性与空间记忆能力关系的研究［J］.中风与神经疾病杂志，2006，23(2):140-142.

［9］Racine RJ，Steingart M，McIntyre DC.Development of kindling-prone and kindling-resistant rats:selective breeding and electrophysiological studies［J］.Epilepsy Res，1999，35(3):183-195.

［10］Bozon B，Davis S，Laroche S.Regulted transcription of the immediate-early gene Zif268:mechanisms and gene dosage-dependent function in synaptic plasticity and memory formation［J］.Hippocampus，2002，12(5):570-577.

［11］Bozon B，Kelly A，Josselyn SA，et al.MAPK，CREB and zif268 are all required for the consolidation of recognition memory［J］.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，2003，358(1432):805-814.

［12］Lee JL，Hynds RE.Divergent cellular pathways of hippocampal memory consolidation and reconsolidation［J］.Hippocampus，2012，29(10):1002.

［13］Liu SY，Ma YL，Lee EH.NMDA receptor signaling mediates the expression of protein inhibitor of activated STAT1(PIAS1)in rat hippocampus［J］.Neuropharmacology，2013，65:101-113.

［14］Honkaniemi J，Sharp FR.Prolonged expression of zinc finger immediate-early gene mRNAs and decreased protein synthesis following kainic acid induced seizures［J］.Eur J Neurosci，1999，11(1):10-17.