AKT信号通路与干细胞增殖

王碧涵，杨万章

1 丝氨酸／苏氨酸激酶（AKT）信号通路概述

PI3－K／AKT信号通路最早被发现在胰岛素刺激及其应答的调控中起重要作用。随着研究的深入和下游底物的不断发现，PI3－K／AKT信号通路作为一条非常重要的细胞内信号转导通路被人们所认识。激素、生长因子、细胞因子、细胞外基质成分和应激等多种因素刺激后，AKT信号通路被活化，在细胞周期调控、细胞生长与存活，细胞增殖与凋亡，细胞的迁移、分化及糖类代谢等的调控中扮演重要角色。AKT执行的复杂功能，主要是通过磷酸化一系列特异性下游底物完成的。近年来对AKT信号通路的研究发现，干细胞的增殖影响AKT及其下游信号分子的磷酸化表达水平，这提示AKT信号系统在调控干细胞的增殖中起着重要的作用。

1.1 AKT的结构 AKT属于AGC蛋白激酶家族[1]，已经被证实是PI3－K／AKT信号通路的中心介导蛋白7年，Staal等[2]在小鼠的反转录病毒AKT8中找到一个癌基因，命名为v－AKT7年，3个独立的研究小组[3－5]先后成功克 隆出AKT基因，发现它是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，并认为AKT可能在酪氨酸和丝氨酸／苏氨酸磷酸化途径中形成功能联系。AKT作为一种相对分子质量约60×103（60KD）的胞内信号蛋白，因其激酶结构域与蛋白激酶A（PKA）和蛋白激酶C（PKC）具有高度同源性，故又被称为蛋白激酶B（PKB）。目前，在哺乳动物中已发现的AKT家族至少包括三种亚型：AKT1，AKT2和AKT3，也被称为PKBα，PKBβ和PKBγ。AKT1在真核细胞中广泛表达，主要调控细胞存活和增殖；AKT2在胰岛素敏感组织中高度表达（如肌肉、脂肪组织），参与胰岛素调节的代谢过程；而AKT3则主要分布在脑和睾丸组织，调节细胞的大小以及数目[6]。它们在结构上具有高度的同源性和保守性，其分子由氨基末端PH结构域、羧基末端调节结构域（包含疏水基）和中间的激酶催化结构域组成，含有thr308、thr450、Ser473和Ser124四个磷酸化调节位点，其中thr308（位于催化结构域）和Ser473（位于调节结构域的疏水基）的磷酸化与AKT活化有关，并且双位点磷酸化才能使AKT完全激活。

1.2 AKT信号通路的调节 AKT是PI3－K／AKT信号通路中的关键信号转导分子，其活化依赖于PI3－K，因此研究中多以磷酸化的 AKT（p－AKT）作为衡量 PI3－K 活性的指标。PI3－K（phosphoinositide 3－kinase，磷脂酰肌3－激酶），是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，根据结构和底物的不同可以分为三型，其中Ⅰ型P13－K参与生长因子和细胞因子激活的信号通路应答，主要介导细胞的生存、增殖、分化等生物学功能[7]。Ⅰ型PI3－K是一种包含催化亚基和调节亚基的异源二聚体，其中调节亚基由三个基因编码，有五种亚型：p85α，p55α，p50α，p85β和 p55γ；催化亚基有三种亚型，p110α，p110β和p110δ，分别由不同基因编码。胰岛素或者生长因子等配体激活受体酪氨酸激酶（RTKs），或者G－蛋白偶联受体受刺激后均能使P13－K磷酸化。在活化的PI3－K作用下，细胞膜上的磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）被磷酸化而转换成磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3），细胞质内的AKT因而被募集到细胞膜并通过氨基末端的PH结构域和PIP3结合并发生构象改变，PDK1（3－phosphatide－dependent kinase，磷脂酰激酶依赖激酶1）得以靠近、催化AKT的thr308磷酸化。但是AKT的完全活化还需要Ser473的磷酸化，后者的磷酸化相对复杂，研究者们曾经推测其磷酸化调节可能与一种假想的名为PDK2的激酶有关，但实际上后来的研究证明依据刺激和环境的不同[8，9]，参与催化该位点的酶是 mTORC2或者 DNA－PK。AKT完全激活后进一步介导其下游信号的级联反应，参与调控细胞的存活、增殖、迁移、分化以及其他细胞代谢活动。随着研究的深入，越来越多的蛋白分子被鉴定为AKT信号通路的特异性下游底物，包括目前研究较多的：促凋亡因子BAD、胱天冬蛋白酶9（caspase－9），促凋亡转录因子Forkhead家族，促生存信号NF－κB，雷帕霉素（mTOR）以及与糖代谢有关的糖原合成激酶－3（GSK－3）等。

PTEN则是AKT信号通路中重要的负性调节分子，通过将PIP3去磷酸化为PIP2来实现对PI3－K的负调节，此外，PP2A和PHLPP1／2分别通过诱导thr308、Ser473的去磷酸化而使 AKT钝化，也起到负性调节作用[10]。人工合成的LY294002是PI3－K的特异性抑制剂，通过阻断PI3－K而实现对PI3－K／AKT信号通路的抑制。

2 AKT信号通路在干细胞增殖中的作用

干细胞可以分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞；依据其所处的发育阶段则分为胚胎干细胞和成体干细胞。近年来干细胞在再生医学研究方面显示出广阔的临床应用前景，成为其中最前沿，最具活力和影响力的研究领域之一[11]。

尽管自我更新和增殖是干细胞的固有性质，但目前对调控其增殖的信号通路及分子机制并不完全清楚。近年来的研究发现AKT信号通路及其下游蛋白的磷酸化表达水平可能决定着干细胞的命运，在维持干细胞未分化状态、调节干细胞自我更新和增殖中起关键作用。

2.1 胚胎干细胞 1998年James等首次成功建立了人胚胎干细胞系，将人卵体外受精培育至早期胚泡，提取内细胞群，最终得到了5个人胚胎干细胞系[12]。然而，胚胎干细胞体外培养扩增时极易分化为其他细胞，限制了干细胞移植的临床应用。

早在1999年，Sun等[13]在研究小鼠胚胎干细胞时就发现，PTEN基因缺陷的细胞完成一个细胞分裂周期的时间较正常时减少5%～10%。这项研究第一次使人们认识到PI3－K／AKT信号通路可能在胚胎干细胞的增殖调控中发挥重要作用。随后的研究进一步证实了这个发现，当用PI3－K特异性抑制剂LY294002处理后，胚胎干细胞的增殖减慢，细胞富集于G1期[14]。周睿卿等[15]以胎鼠成纤维细胞作为饲养层，二维培养的方法培养人胚胎干细胞并观察其生长状态，以饲养层细胞、肿瘤细胞K562细胞株作为对照，结果发现，人胚胎干细胞在未分化状态时Pten抑制的PI3－K／AKT／mTOR信号通路下游磷酸化关键蛋白活性较低。研究者推测，PI3－K／AKT／mTOR信号通路在胚胎干细胞的自我复制和分化中起到重要作用，更由此猜想如果抑制负调节蛋白PTEN或直接激活该通路正调节关键蛋白，可能会加快人胚胎干细胞增殖、减少凋亡。

2.2 成体干细胞 脑缺血等损伤可以激活成年大脑内源性神经干细胞，促使其增殖、产生新的神经元并向损伤部位募集，这种现象在侧脑室外侧壁的室管膜下区（SVZ）和海马齿状回颗粒下层（SGZ）尤其明显[16，17]。但是这种调控机制至今仍未完全阐明，研究表明微环境的改变、神经营养因子以及信号转导通路等可能都参与其中7年，Kitagawa等首次报导在永久性大鼠大脑中动脉缺血模型中观察到PI3－K／AKT信号通路的激活，这提示AKT信号通路可能在神经干细胞的增殖方面起作用[18]。随后的大量研究证实这种内源性的干细胞增殖调控涉及多条信号通路，其中由生长因子激活的PI3－K／AKT信号通路可能在干细胞生长、存活以及增殖中扮演重要角色[19－21]。这在赵宇等[22]体外培养的大鼠神经干细胞实验中也得到证实，应用不同浓度梯度的PI3－K特异性抑制剂LY294002孵育后进行细胞存活、增殖等检测，结果发现LY294002阻断AKT信号通路呈剂量依赖性，且随着浓度升高，p－AKT含量降低，大鼠神经干细胞的增殖受到明显抑制。

此外，有关AKT信号通路参与其他成体干细胞如心脏干细胞、间充质干细胞、造血干细胞等增殖调控的相关报道也有许多。成熟的心脏组织中仍然存在少量干细胞，有研究表明其数量只占正常心肌细胞的1%[23]。赵岚等[24]证实，心肌梗死同样促进内源性心脏干细胞增殖，PI3－K／AKT信号通路参与了大鼠心肌梗死后心脏干细胞的动员调节。在大鼠冠脉阻塞模型中观察到，急性缺血诱导局部心肌AKT表达水平和干细胞数量同步进行性升高，AKT抑制剂显著抑制上述各项指标的动态演变，使心肌梗死面积进一步恶化。Gharibi等[25]利用血小板源生长因子受体β体外培养人间充质干细胞，发现P13－K／AKT／mTOR以及下游相关蛋白p70S6K和4E－BP1与干细胞增殖调控有关，另一条信号通路ERK则介导间充质干细胞的分化。Perry等[26]揭示 Wnt（β）－catenin和 PI3－K／AKT 信号通路的共同作用下，造血干细胞才能实现自我更新和扩增。

同样有研究报导称AKT信号通路与干细胞的分化密切相关。Isomoto等[27]应用 mTOR特异性抑制剂rapamycin阻断PI3－K／AKT／mTOR信号通路后发现成骨分化受抑制，这提示PI3－K／AKT／mTOR信号通路的活化与成骨前体细胞即间充质干细胞的分化有关。国海东等[28]研究表明在骨形态发生蛋白－2（BMP－2）诱导的骨髓源性心肌干细胞向心肌细胞分化中，PI3－K／AKT信号通路发挥了重要的调控作用。成体干细胞在发育过程中，既要维持自我增殖，又要进一步分化为各种类型细胞，在其分化和增殖之间应该存在着一种平衡调节机制，可能AKT信号通路正是这种平衡途径之一。

3 AKT信号通路与肿瘤发生

近年来AKT信号通路与肿瘤发生的关系也日益受到人们的关注。AKT的过度表达或者PTEN等负调控机制的失活与恶性肿瘤的发生密切相关，在多种恶性肿瘤中可以检测到该通路信号蛋白及其调节分子的异常表达[29，30]。蔓小红等[31]研究发现，尖锐湿疣和宫颈鳞状细胞癌中PI3－K／AKT信号通路被异常激活，HPV有可能通过影响PI3K和P－AKT的表达上调进而引起感染上皮的异常增殖。研究已经证实PI3－K／AKT信号通路参与调节肿瘤细胞的增殖、存活和迁移，目前以该通路及其关键分子为治疗靶点的肿瘤治疗新策略也成了研究热点。张辉等[32]的研究表明，AKT激酶在前列腺癌生长、发展以及激素依赖性向激素非依赖性的转变过程中起着重要作用。p－AKT蛋白磷酸化水平在AKT磷酸化激活过程中占主导地位，是AKT激活的必要过程。米非司酮抑制前列腺癌PC－3细胞的增殖，诱导细胞凋亡，其机制可能是通过抑制AKT信号转导通路，从而激活Caspase。

4 中医中药

最近天津中医药大学的一个研究小组从传统中药丹参中提取出了45种活性成分[33]，一一检测其对于体外培养的神经干／祖细胞的增殖诱导能力，筛选结果提示丹酚酸B对神经干／祖细胞具有促进增殖作用，并且这种促进作用呈时间－剂量依赖关系，其调控的分子机制可能与PI3－K／AKT信号通路有关；动物实验也证实丹酚酸B可以通过干预PI3－K／AKT信号通路介导短暂性脑缺血大鼠模型大脑神经干细胞的自我更新和增殖。丹参抗肝纤维化的作用已经被证实，丹参的水溶性有效成分丹参素具有保护肝细胞，显著抑制肝星状细胞增殖并促进其凋亡的作用[34]。王珏等[35]研究提示不同浓度的丹参素和渥曼青霉素作用于肝星状细胞24h后，细胞中磷酸化AKT（p－Akt）表达随药物浓度增加表达逐渐减弱，这说明丹参素和渥曼青霉素对肝星状细胞增殖的抑制作用与其抑制PI3－K／Akt信号通路中AKT的活化有关。赖真等[36]研究发现，黄芪可刺激PI3－K／AKT信号通路的表达，减轻大鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡。

5 展 望

目前的研究揭示AKT信号通路参与了干细胞的自我更新和增殖调控，未来研究的一个方向极有可能以此为调控靶点，筛选药物，提高干细胞的增殖率，进而为干细胞治疗和再生医学提供更多的细胞来源，使干细胞疗法在“不治之症”的治疗方面得到更广泛的应用。Jun等[37]研究发现，原钒酸钠通过干预AKT和ERK信号通路促进中风大鼠大脑SVZ区的神经前体细胞增殖。由此推测，原钒酸钠可能因此成为治疗脑中风的潜在药物。但是这种调控机制是非常复杂的，可能不止涉及一条信号通路，而是多条通路的相互作用、相互影响。有关干细胞增殖的精确调控机制以及胞内信号通路间的相互作用尚有待进一步的研究证实。

小鼠AKT基因敲除实验表明PI3－K／AKT信号通路的正常表达维持细胞的生存、代谢和分化，但是AKT的持续异常活化介导的抗凋亡、促增殖等作用却与肿瘤发生密切相关。由此可知AKT信号通路是一把双刃剑，如何控制干细胞的增殖和分化，真正使基础研究成果转向临床应用，不仅需要更加广泛深入的研究，更需要慎重的科学态度。

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