中毒患者血液中普罗帕酮LC-MS/MS检测方法的建立

孙成文，李嘉琳，王玉江，徐水英，孙爱丽，赵玉婧，邱泽武

中毒患者血液中普罗帕酮LC-MS/MS检测方法的建立

孙成文，李嘉琳，王玉江，徐水英，孙爱丽，赵玉婧，邱泽武

目的：建立人血液普罗帕酮LC-MS/MS检测方法，用于普罗帕酮中毒患者的诊断。方法：取患者静脉全血，分离血清500μl，加1000μl乙腈混匀，离心沉淀，上清液用针头滤器过滤，取10μl进样。在串联四级杆质谱电喷雾电离（ESI）正离子电离模式下，监测m/z342.2/116.1和342.2/324.2两对多反应离子（MRM）进行普罗帕酮检测。分析保留时间（RT），确定线性范围，计算检出限、精密度和稳定性。结果：普罗帕酮保留时间为5.08min，在1～1000 ng/mL的范围内线性关系良好（r= 0.9984），最低定量限（LOQ）为0.1ng/mL，日内精密度RSD为3.9%，日间精密度RSD为6.0%，平均回收率为96.5%，普罗帕酮在室温环境中较为稳定。结论：建立LC-MS/MS检测普罗帕酮的方法灵敏、快速，特异性好，适用于普罗帕酮中毒患者的诊断与指导治疗。

普罗帕酮；液相色谱-质谱联用；血液分析；中毒

普罗帕酮，为高效膜抑制性抗心律失常药。具有膜稳定作用及竞争性β阻滞作用。能降低心肌兴奋性，延长动作电位时程及有效不应期。临床可用于治疗室性和室上性异位搏动，心动过速，预激综合征等疾病。近年来，临床常见误服或过量服用普罗帕酮导致中毒的现象，患者出现低血压，心动过缓，传导阻滞等，严重者还会发生昏迷、抽搐、重度心律失常甚至死亡[1-2]。检测血液中普罗帕酮浓度可以协助临床中毒患者的诊断与治疗。国内外已有相关血液普罗帕酮的液相色谱检测方法，但多是从药代动力学和正常血药浓度监测的角度研究的，不适合临床普罗帕酮中毒患者的抢救需要[3-5]。液相色谱-质谱法具有灵敏度高和选择性好等特点，本文利用液相色谱-质谱联用仪（LC-MS/MS）建立了一种较适合于中毒患者血液普罗帕酮的快速检测方法。

1 资料和方法

1.1 仪器 超快速液相色谱仪（Prominence UFLC，LC-20AD，日本岛津有限公司）、AB SCIEX三重四极杆串联质谱仪（API3200，LC-MS/MS，配有电喷雾离子源和大气压化学源，美国应用生物系统公司）、Mil l iQ超纯水器（美国Mi l l ipore公司）、万分之一电子分析天平（AG285，瑞士Met t ler-Toledo）、离心机（LG20-W，北京立离心机有限公司）。

1.2 试剂 盐酸普罗帕酮（99.9%，中国计量科学研究院）；用1∶1甲醇（HPLC级，Fisher Scienti f ic公司）水配制1mg/ml普罗帕酮溶液储存4℃备用；乙腈（HPLC级，Fisher Scienti f ic公司）；甲酸（分析纯，DIMA公司）；乙酸铵（分析纯，DIMA公司）；液氮（≥99.9%，北京东方医用气体公司）；纯水（18.2MΩ，Mil l iQ超纯水器所制）；10份健康人混合血清（解放军307医院输血科）。

1.3 配制标准曲线与质控样本 取1mg/mL普罗帕酮储存液，分别配制1.0 ng/ml、10.0 ng/ml、100.0 ng/ml、500.0 ng/ml、1000.0 ng/ml浓度的血清样品制备标准曲线，配制10.0 ng/ml、100.0 ng/ml、500.0 ng/ml三个浓度观察回收率、精密度、稳定性等方法学指标。

1.4 样品前处理 取患者静脉血液，离心分离血清500μl，加乙腈1000μl，振荡器震荡1 min。18 000 rpm高速离心（20 979 g），取上清液1000μl 0.22μm滤膜针头滤器过滤到样品瓶，10μl上机进样。

1.5 仪器分析条件

1.5.1液相色谱条件 色谱柱（Shim-pack XR-ODS 100Lx3.0色谱柱 岛津公司），柱温箱温度40℃，10μl进样；流动相：A相（5%甲醇水溶液+2mmol乙酸铵+1‰甲酸），B相（95%甲醇水溶液+2mmol乙酸铵+1‰甲酸），分析时间及A、B两流动相流率变化。见表1。

1.5.2 质谱条件 离子源为电喷雾电离（ESI），ESI正离子电离模式下，监测m/z 342.2/116.1和342.2/324.2两对多反应离子（MRM）；离子源雾化温度：450℃；气帘气（CUR）10 psi，雾化气（NEB） 50 psi，碰撞气（CAD）5psi，电喷雾电压（IS）4500V，采用MRM模式进行正离子检测。

1.6 定性与定量检测 在同等条件下比对色谱峰的保留时间及两对定性离子的相对丰度与普罗帕酮标准品一致，则可判定为普罗帕酮。定量采用外标法。

2 结果

2.1 质谱监测离子的选择 在ESI正离子模式下，用浓度1000 ng/ml的普罗帕酮溶液以针泵10.0μl/min的速度连续进样质谱仪进行全扫描，获得普罗帕酮的[M+H]342.2准分子离子峰，以其作为母离子进行轰击，获得普罗帕酮二级全扫描质谱。见图1。选择信号较强、分子量较大的m/z 342.2/116.1和342.2/324.2两对离子在MRM模式下，进一步优化两对监测离子去簇电压（DP）、射入电压（EP）、碰撞能（CE）和碰撞池出口电压（CXP）等参数。见表2。

2.2 保留时间及特异性 分别取空白血清和100 ng/ml的血清样品500μl按“1.4”项处理上机进样10μl，普罗帕酮的保留时间为5.08min，未发现人血液样品本底对普罗帕酮有干扰。

2.3 标准曲线及检测限 取1.0ng/ml、10.0ng/ml、100.0ng/ml、500.0ng/ml、1000.0ng/ml 5个浓度的普罗帕酮血清样品建立曲线。以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得线性方程为Y＝1.49× 103X＋1.82×103，r=0.9984。选择 m/z 342.2/ 116.1定量普罗帕酮，方法检定量检出限（LOQ）为0.1 ng/ml（信噪比S/N=10）。

2.4 回 收 率 取 10.0 ng/ml、100.0 ng/ml、500.0 ng/ml 3个浓度普罗帕酮血清样品按“1.4”项处理，观察普罗帕酮的回收率，每个实验重复6次。结果10.0 ng/ml、100.0 ng/ml、500.0 ng/ml 3个浓度的平均回收率分别为98.3%、96.0%和95.2%，RSD分别为4.8%，4.2%，5.0%。

2.5 日内与日间精密度 取10.0ng/ml、100.0ng/ml、500.0 ng/ml 3个浓度普罗帕酮样品观察精密度。于第1天内测定3个样品6次，计算日内精密度RSD分别为5.1%，3.5%，3.0%；另分别将这3个样品于第6天内连续测定，测得3个浓度日间精密度RSD分别为7.5%，4.2%，6.4%。

2.6 稳 定 性 将 10.0 ng/ml、100.0 ng/ml、500.0 ng/ml 3个浓度的血清样品放置室温观察普罗帕酮在血清中的稳定性。分别于4 h、8 h、24 h测定普罗帕酮浓度，3个样品每个时间点均进样6次，结果浓度没有明显变化。见表3。表明室温条件下普罗帕酮在血清中稳定性较好。

3 讨论

普罗帕酮又称心律平，化学名为丙胺苯丙酮，结构中含有电负性较强的氮元素。见图2。本文在ESI正离子模式下，对普罗帕酮进行Q1和MS2扫描，均获得了较强的信号响应，为选择LC-MS/MS-ESI正离子模式检测普罗帕酮提供了基础；在本方法中，采用“血液0.5ml+乙腈1ml，离心、过滤、上机进样”的普罗帕酮提取方法，步骤简短，可大大地缩短检测时间。平均回收率达到96.5%，完全可以满足临床中毒患者的抢救需要。由于中毒患者有可能服用多种药物，患者血液中还可能会有治疗用药，成分较为复杂。所以，在色谱条件中，我们选择了一个相对复杂的流动相和梯度洗脱条件，主要目的是为了使样品中的目标化合物均得到较好的分离，以增加检测的准确性；因为本试验所涉及对象大多为中毒患者，因此建立标准曲线时选择了较宽的浓度范围，以便能尽量涵盖重度中毒患者的高血药浓度。所得标准曲线r值大于0.99，相关性较好。如果患者中毒病情较重，普罗帕酮血液浓度较高，超出本方法的线性范围，可对患者血清进行10倍稀释，以确保检测结果的准确性。近年来，利用本方法检测了11例普罗帕酮过量的患者，男3例，女8例，年龄19～47岁。11例患者血液普罗帕酮浓度范围为1530～4920 ng/ml，取得了良好效果。

[1]吕方方，李国强，杨 波.普罗帕酮急性中毒致心律失常和呼吸衰竭1例[J].药物不良反应杂志，2011，5（13）：301-302.

[2]孙宏杰，吴 旭，官大威，等.普罗帕酮中毒死亡1例[J].法医学杂志，2010，6（26）：475-476.

[3]董军亚，张继红，焦晓红，等.高效液相色谱法测定人血清中普罗帕酮的浓度[J].武警医学，2006，6（17）：427-429.

[4]李东升，张才丽.高效液相色谱法同时测定兔血清中普罗帕酮和奎尼丁的浓度[J].天津医科大学学报，2004，2（10）：238-239.

[5]陈 鹰，裘 军，吴 梅，等.反相高效液相色谱法选择性测定血浆中普罗帕酮对映体[J].中国药师，2000，1（3）：36-37.

（收稿：2013-05-27 修回：2013-06-17 编校：齐 彤）

Foundation of the HPLC-MS/MSmethod to analyze propafenone in blood of poisoned patients

SUN Cheng-wen,LIJia-lin,WANG Yu-jiang,XU Shui-ying，SUN Ai-li，ZHAO Yu-jing，QIU Ze-wu.The 307Hospitalof PLA,Beijing 100071,China

Objective：To establish a HPLC-MS/MSmethod for the testof propafenone in human blood,and diagnose the poisoning patients.Methods：500μl serum divided from venous blood wasmixed w ith 1000μl acetonitrile.After centrifugation and precipitate,10μl samplewas tested from the filtered clear supernatant.The sample preparationwas deproteinized and extracted w ith acetonitrile followed by HPLC-MS/MS inmultiple reactionmonitoringmode,the transition ions ofm/z342.2/116.1 and m/z342.2/ 324.2 were selected for quantification of propafenone,propafenonewas quantified based on external standard calibration curve.Results：The retention time of calibrationwas5.08min，calibration curvewere linear over the range of 1～1000 ng/m L(r=0.9984)and the lower lim itof quantitation(LOQ)was 0.1 ng/m L(S/N=10).The intra-and inter-day precisions(RSD)were 3.9%and 6.0%,respectively.The average extraction recovery was 96.5%.The analysiswas proved to be stable under room temperature.Conclusion：Themethodwas rapidly and easy to usew ith good sensitivity and specificity.Itcan beused for clinicaldiagnosisand treatment.

propafenone；liquid chromatography-tandem mass；blood analysis；poisoning

R 595.4

A

2095-3496（2013）03-0149-03

100071 北京，解放军307医院全军中毒救治中心（孙成文，李嘉琳，徐水英，孙爱丽，赵玉婧，邱泽武）；北京市丰台区疾病预防控制中心（王玉江）

邱泽武，E-mai l：qiuzw@em120.com