石菖蒲水煎剂对癫痫大鼠脑部神经发生及认知功能的影响

李海峰 王 慧 夏哲智 浙江大学医学院附属儿童医院 杭州 310003

赵彦婷 河北省平山县人民医院

石菖蒲水煎剂对癫痫大鼠脑部神经发生及认知功能的影响

李海峰 王 慧 夏哲智 浙江大学医学院附属儿童医院 杭州 310003

赵彦婷 河北省平山县人民医院

目的：探讨石菖蒲水煎剂对癫痫大鼠脑部神经发生的影响和对癫痫认知障碍的治疗作用。方法：SD大鼠30只，随机分为正常对照组、癫痫模型组和石菖蒲灌胃组，每组10只。癫痫模型组和石菖蒲灌胃组采用印防己碱（PTX）建立癫痫动物模型，采用5-溴脱氧尿苷嘧啶（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）腹腔注射标记内源性神经干细胞（NSC）。正常对照组、癫痫模型组予生理盐水灌胃，石菖蒲灌胃组予石菖蒲水煎剂10mg/（kg·d）灌胃，共30天。治疗前后进行鼠癫痫发作Racine评级、皮层脑电图检测、脑内BrdU阳性细胞免疫组化检测和Morris水迷宫检测。结果：Morris水迷宫检测显示，癫痫模型组逃避潜伏时间长于石菖蒲灌胃组和正常对照组（P＜0.05）；癫痫模型组目标象限内的游泳时间占整个游泳时间的百分率明显低于石菖蒲灌胃组和正常对照组（P＜0.05）。石菖蒲灌胃组大鼠Ⅲ～Ⅴ级癫痫发作频率、皮层脑电图频率、波幅降低、Brdu阳性细胞数升高，与癫痫模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：大鼠发生癫痫后，启动自我保护机制，石菖蒲干预后明显增强了保护机制。

大鼠 癫痫 石菖蒲水煎剂 认知功能

癫痫是一组反复发作的神经元异常放电所致的暂时性中枢神经系统功能失常的慢性疾病，是神经系统仅次于脑血管疾病的第二大病种，严重影响患者生活质量。国内流行病学调查表明，我国癫痫的发病率约23/10万，现有约455～630万癫痫患者[1]。虽然新的抗癫痫药物不断出现，但国内外众多回顾性研究显示癫痫的1年缓解率为70%～80%，约20%～30%癫痫患者发作得不到缓解，成为慢性难治性癫痫（intractable epilepsy）。长期反复发作及药物副作用严重威胁着癫痫患者的日常生活[2]。中药因其副作用小，用于对抗癫痫备受关注[3]。石菖蒲为天南星科（Araceae）多年生草本植物石菖蒲Acori Tatarinowii Rhizoma的干燥根茎，具有化痰开窍、化湿和胃、醒神益智、理气活血、散风祛湿等功效[4]。临床和实验观察发现石菖蒲在中枢神经系统方面主要有抗惊厥、镇静催眠、促进学习记忆等作用[5-6]。本研究应用石菖蒲水煎剂治疗印防己碱（PTX）癫痫动物模型大鼠，观察石菖蒲水煎剂对大鼠脑部神经发生的影响以及对癫痫认知障碍的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂 6周龄清洁级SD大鼠，体质量（150±20）g，浙江省医学科学院动物中心提供，实验动物合格证：SCXK（浙）2008-0033；印防己碱（PTX）（Sigma公司，美国）；5-溴脱氧尿苷嘧啶（5-bromo-2 -deoxyuridine，BrdU）（Sigma公司，美国）；鼠抗Brdu单克隆抗体（Sigma公司，美国）；兔抗GFAP（星型胶质细胞酸性蛋白）多克隆抗体（Zymed公司，美国）；鼠抗TUJ-1（神经元tao蛋白）单克隆抗体（Promega公司，美国）；羊抗Nestin（神经巢素蛋白）多克隆抗体（Promega公司，美国）；DAPI（Roche公司，美国）；羊抗鼠Cy3荧光二抗，羊抗兔Cy3荧光二抗（Sigma公司，武汉博士德分装）；鼠抗羊FITC荧光二抗，羊抗鼠FITC荧光二抗（中山金桥公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 SD大鼠30只，随机分为正常对照组、癫痫模型组和石菖蒲灌胃组，每组10只。

1.2.2 印防己碱（PTX）慢性癫痫模型制备 PTX用生理盐水配成1mg/mL溶液，注射前24h新鲜配制，大鼠每天晨8～11时腹腔注射PTX 1.5mg/（kg·d），共20天，正常对照组腹腔注射同等剂量生理盐水。每次注射后根据Racine标准观察大鼠行为（1小时），判定是否出现癫痫样发作。Racine标准：0级：无惊厥；I级：面部阵挛；Ⅱ级：I级+节律性点头；Ⅲ级：Ⅱ级+前肢阵挛；Ⅳ级：Ⅲ级+后肢站立；Ⅴ级：Ⅳ级+跌倒。将连续3次Ⅳ～Ⅴ级发作认为动物被完全点燃，即癫痫模型造模成功，继续腹腔注射PTX 1.5mg/（kg·d）以维持点燃效果，将5次以上Ⅲ级及Ⅲ级以上发作纳入实验组，死亡及其他则剔除实验。

1.2.3 内源性神经干细胞标记 造模成功后，癫痫模型组、石菖蒲灌胃组大鼠予BrdU注射，剂量50mg/（kg·d），连续注射7天以标记内源性神经干细胞。

1.2.4 石菖蒲水煎剂干预 造模成功后，石菖蒲灌胃组予新鲜制备的33%石菖蒲水煎剂灌胃，剂量10mg/（kg·d）；正常对照组、癫痫模型组予等量生理盐水灌胃。干预时间共30天。

1.3 检测指标 观察各组干预前后癫痫发作频率及以下指标。

1.3.1 Morris水迷宫学习记忆功能 ①定位航行实验：实验前1天将大鼠置于水迷宫中自由游泳30min，以适应水迷宫环境。在学习过程中，大鼠连续训练5天，每天分2个时段，每个时段训练2次，间隔为60min。每次实验大鼠在4个不同象限中将头朝池壁放入水池，每天次序不同，任其游泳，直至找到平台（平台象限设置在Ⅰ象限）。记录120s内寻找到水下平台的时间（逃避潜伏期），并允许大鼠在平台上停留10s以达到强化记忆效果；如果大鼠在120s内未到达平台，逃避潜伏期以120s记录，并由实验者用杆子将其引至平台停留30s，此项反应大鼠的学习能力。②空间探索实验：实验第6天进行，撤除平台，任意选1个入水点将大鼠放入水中，记录其在60s内的游泳轨迹，分别计算其跨越目标象限内的游泳时间占整个游泳时间的百分率、跨越平台次数，此项反应大鼠的空间记忆能力。

1.3.2 大鼠脑皮层脑电图 大鼠1%戊巴比妥（30mg/ kg腹腔注射）麻醉后，固定在定位仪上，剪去头顶部头皮，暴露颅骨，按大鼠脑图谱，选定双侧海马坐标（前后3.6mm，中线旁开4.9mm，颅骨表面下0.5mm），在颅骨相应位置上钻一直径0.8mm小孔，分别埋入一单芯电极，以牙托粉固定，作为记录皮层脑电图的引导电极。术后连续3天，予头部皮肤清洁消毒，并腹腔注射卡那霉素0.5mL预防感染；待大鼠基本恢复正常后，利用多向生理记录仪对脑电图进行记录，参数设置：灵敏度500μV，滤波100Hz，扫描速度200ms/div，以出现尖波、棘波、尖（棘）慢波为痫性发作。致痫后连续记录10min，然后每间隔5min记录lmin，记录1小时；并同时观察大鼠行为，予石菖蒲干预后再次记录脑电图。

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1.3.3 免疫组化检测脑内神经干细胞增殖、迁移及其分化情况 组织切片的制备：大鼠接受皮层脑电图后立即进行心脏灌注固定，固定后用4%多聚甲醛浸泡继续固定24h，分别经过15%及30%蔗糖4℃梯度脱水24h。从视交叉后2mm至侧脑室后角行连续冠状冰冻切片，片厚30μm，切片保存于4℃0.01M PBS缓冲液中，1周内完成免疫化学检测。免疫组织荧光三标（DAPI/BrdU/Nestin、DAPI/BrdU/GFAP、DAPI/ BrdU/TUJ-1）检测：切片入0.2%Triton X-100溶液中，37℃孵育30min，之后入2mol/L HCl中37℃作用30min，再入正常山羊血清封闭液，37℃孵育30min，切片入Brdu一抗液（鼠抗BrdU单克隆抗体）中，湿盒内4℃冰箱孵育48h。切片入荧光二抗，湿盒内37℃孵育30min。之后进行第二种神经性一抗（羊抗Nestin多克隆抗体，兔抗GFAP多克隆抗体，小鼠抗TUJ-1单克隆抗体）4℃孵育24h，荧光二抗湿盒内37℃孵育30min，最后贴片，50%缓冲甘油封片，激光共聚焦扫描显微镜下观察。

1.4 统计学方法 应用SPSS13.0软件进行统计学分析，实验数据以均数±标准差（±s） 表示，采用方差分析，用Bonferroni法进行两两比较，对于方差不齐同的组间比较用Welch法进行分析，以P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 石菖蒲干预前后癫痫发作频率比较 造模后癫痫模型组、石菖蒲灌胃组大鼠癫痫Ⅳ～Ⅴ级发作次数分别为（2.3±0.6）次和（2.5±0.5）次，组间差异无统计学意义（P＞0.05）；Ⅲ级发作次数分别为（8.8±1.6）次和（8.5±1.8）次，组间差异无统计学意义（P＞0.05）；分别接受生理盐水灌胃及石菖蒲灌胃后Ⅳ～Ⅴ发作次数分别为（2.5±0.9）次和0次，组间差异有统计学意义（P＜0.05）；Ⅲ级发作次数分别为（8.7±2.1）次和（2.3±0.8）次，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 干预前后皮层脑电图频率及波幅比较 造模前，各组皮层脑电图基础频率、基础波幅均为正常范围，各组间差异无统计学意义（P＞0.05）；造模后，癫痫模型组、石菖蒲灌胃组大鼠皮层脑电图基础频率、基础波幅均明显升高（P＜0.05），两组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后，癫痫模型组、石菖蒲灌胃组大鼠皮层脑电图频率、波幅比较，差异有统计学意义，石菖蒲灌胃组明显少于癫痫模型组（P＜0.05），见表1。

表1 各组皮层脑电图频率及波幅比较（x±s）

注：与造模前比较，*P＜0.05；与癫痫模型组比较，△P＜0.05

组别正常对照组癫痫模型组石菖蒲灌胃组频率/Hz 6.7±1.2 6.2±1.6 7.1±1.2波幅/μV 38.7±4.2 40.2±3.8 37.5±4.1 n/只10 10 10频率/Hz 5.9±1.1* 19.3±4.2* 19.8±4.9*波幅/μV 37.6±3.4* 468.6±23.6* 479.3±21.9*频率/Hz 6.1±1.3 20.5±4.7* 10.4±3.2△波幅/μV 39.1±4.0 475.6±27.1* 132.5±14.3*△造模前 造模后 治疗后

2.3 石菖蒲干预后神经行为改变

2.3.1 Morris航行定位实验 正常对照组、癫痫模型组和石菖蒲灌胃组的逃避潜伏时间分别为（14.16± 2.90）s、（62.63±6.660）s、（30.60±5.30）s，癫痫模型组逃避潜伏时间明显高于石菖蒲灌胃组和正常对照组（P＜0.05）。

2.3.2 Morris空间探索实验 正常对照组、癫痫模型组和石菖蒲灌胃组的平台象限泳距占总泳距的比例分别为0.62±0.04、0.31±0.03、0.48±0.03，三组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。

阳性细胞增殖：BrdU阳性免疫组织化学显示，正常对照组、癫痫模型组和石菖蒲灌胃组BrdU阳性细胞数分别为（203.50±15.12）个/视野、（241.63±19.02）个/视野、（305.75±24.12）个/视野，三组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。②内源性BrdU阳性细胞分化：本实验中选择双侧大脑脑片上、中、下、左、右5个随机视野进行检测比较，三组间三种蛋白表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

3 讨 论

目前认为石菖蒲抗癫痫作用机制为[7]：通过降低兴奋性氨基酸的含量，保护脑细胞；通过降低海马神经元内NMDAR1的表达水平，降低细胞表面NMDAR1密度，和（或）抑制其活性，进一步降低大脑皮层的兴奋性，提高癫痫发作的阈值，抑制NMDA引起的兴奋性神经毒性导致的癫痫发生发展；通过延长惊厥潜伏期以及延缓惊厥发生时间抑制脊髓兴奋；抑制脑内兴奋性氨基酸类神经递质谷氨酸的释放，进而影响脑内c-fos基因的表达；通过提高Bcl-2的表达，抑制癫痫诱导的神经元凋亡；通过清除自由基，组织过氧化物形成，减少一氧化氮的神经毒性，对脑细胞也具有良好的保护作用；可以逆转癫痫幼鼠运动行为即空间学习记忆的能力损伤。本研究显示，石菖蒲煎剂干预可以明显降低PTX癫痫模型大鼠癫痫发作次数和发作级别（P＜0.05），明显减少其脑电频率及脑电波幅（P＜0.05）；同时，大鼠学习记忆功能得到明显的改善（P＜0.05）；本研究还发现石菖蒲能促进大鼠内源性神经干细胞的增殖、迁移及分化（P＜0.05），以改善脑电活动而达到抗癫痫作用。

正常情况下，成年啮齿类动物大脑中有新生神经元不断产生，以补充已经缺失的神经元，这样成年后大脑神经元数目才能保持相对稳定[8]。尽管在正常状态下成年大鼠的神经再生水平很低，但大脑在不同的病理状态下试图进行自我修复，如癫痫、脑缺血和创伤等病损状态可以上调脑室下区和海马等部位的神经干细胞活性，全脑性和局灶性脑缺血能够有效地诱导海马齿状回的神经再生[9-10]。但内源性NSCs数量有限，在大多数情况下，仅由内源性NSCs产生的神经组织不足以替代损伤后缺失或损伤的神经组织。而石菖蒲具有多种药理作用，可以促进癫痫鼠内源性NSCs迁移、增殖、分化，其机制可分为NSCs内在因素和外在因素，包括Wnt信号通路、Notch信号通路、Janus激酶信号转导通路等，尚有某些细胞因子的参与[10]。我们推测石菖蒲促进癫痫鼠内源性NSCs迁移、增殖、分化的机制与其可以稳定内环境有关外，还可能与调控上述信号通路或刺激一些关键的细胞因子产生有关，有待于进一步研究证实。

由于受到伦理学的限制，目前，诸多研究都致力于外加刺激以促使内源性NSCs的自身激活。而石菖蒲在诱导NSCs增殖和分化上显示出巨大的潜力，提示石菖蒲具有较强的抗癫痫应用价值。

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Effect of Water Decoction of Rhizoma Acori Tatarinowii on Epilepsy Rats'Brain and Cognitive Function LI

Haifeng，ZHAO Yanting，WANG Hui，et al.The Children's Hospital affiliated to Zhejiang University School of Medicine，Hangzhou（310003），China

Objective：To explore the effect of the water decoction of rhizoma acori tatarinowii on brain neurogenesis and cognitive handicap of epilepsy in rats.Methods：Thirty SD rats were randomly divided into 3 groups，including control group，model group，and intervention group.Epilepsy model was established by picrotoxin in the model and intervention groups.Rats in the intervention group was given the water decoction of rhizoma acori tatarinowii of 10 mg/（kg·d）for 30d.Saline was given in the same way as described in the intervention group to the control and model groups.Studies on SVZ and DG region of BrdU positive cells in rat brain and immunohistochemical detection and Morris water maze experiment were carried out.Results：Morris water maze results showed that escape la tency time of the model group was longer than that of the intervention group and the control group（P＜0.05）.In spatial probe test，the percentage of the swimming time of the model group was significantly lower than that of the intervention and control groups（P＜0.05）.Cortical EEG results revealed that the Rhizoma acori tatarinowii interven tion improved the cerebral cortex stimulation threshold（P＜0.05）.Brdu+cell number of the intervention group signif icantly increased as compared with that of the model group（P＜0.05）.Conclusion：Epilepsy rats start the self-protection mechanism，and the rhizoma acori tatarinowii intervention can obviously enhance the protection mechanism.

rats epilepsy rhizoma acori tatarinowii cognitive

2013-06-10

表2 各组脑内BrdU阳性细胞Nestin、GFAP、TUJ1表达率比较

注：三组间比较，P＜0.05

组别正常对照组癫痫模型组石菖蒲灌胃组n/只10 10 10 Nestin/% 81.75±5.15 63.19±5.27 55.81±5.02 GFAP/% 10.17±3.00 20.75±3.59 23.93±2.80 TUJ1/% 2.14±1.16 7.12±2.21 17.12±2.50

浙江省中医药科技计划项目（No.H20091187）