针刺及川芎嗪对急性药物性聋豚鼠耳蜗内氧自由基生成影响实验研究

韩明训 赵乌兰 王一鸣 王永华 沈晓丽 浙江中医药大学听力与言语科学学院 杭州 310053

·论 著·

针刺及川芎嗪对急性药物性聋豚鼠耳蜗内氧自由基生成影响实验研究

韩明训 赵乌兰 王一鸣 王永华 沈晓丽 浙江中医药大学听力与言语科学学院 杭州 310053

目的：探讨川芎嗪（TMP）、针刺单独应用及联合使用对庆大霉素（GM）致聋豚鼠耳蜗内氧自由基生成的影响。方法：50只健康豚鼠随机分为正常组、模型组、川芎嗪组、针刺组及TMP+针刺组，每组10只，正常组按2.5mL/（kg·d）剂量腹腔注射生理盐水，其余各组腹腔注射庆大霉素100mg/（kg·d），连续14天，TMP组、针刺组、TMP+针刺组同时灌服TMP和（或）针刺相关穴位。造模结束后迅速断头处死，取耳蜗标本。正常组与模型组动物于用药前及停药后第1天分别测试听觉脑干诱发电位（ABR）以判断造模是否成功；硫代巴比妥法检测血清丙二醛（MDA），黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶（SOD）。结果：各治疗组与模型组比较MDA表达均明显减少（P＜0.01），尤以TMP+针刺组改善明显（P＜0.01）。各治疗组SOD活力均有提高，各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：针灸配合TMP明显提高耳蜗组织内SOD活力，防止脂质过氧化，对急性耳毒性药物早期损伤具有一定的防治作用。

豚鼠 药物性聋 川芎嗪 针刺 氧自由基

自由基作为机体新陈代谢的正常副产物，体内所有细胞均可产生，并且可被各种防御体系灭活，使之维持在正常水平。但是某些病理因素能导致自由基生成过多，从而对机体造成损伤[1]。川芎嗪（TMP）是中药川芎的有效成分，能降低庆大霉素（GM）对内耳毛细胞的毒性损害[2]；而针刺脏腑组织器官所关联的穴位可增强药物在机体内的靶向效应[3]。本实验通过观察针刺和川芎嗪对GM致聋豚鼠耳蜗内氧自由基的影响，探讨川芎嗪（TMP）配合针刺对急性药物性聋豚鼠的防治作用及机制。

1 材料与方法

用U/mL表示，MDA含量用μmol/L表示。

1.6 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件对各组数据进行统计分析，多组间均数比较用方差分析。实验数据以均数±标准差（±s）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

1.1 动物选择及实验分组 健康级白色红目豚鼠50只，体质量240～310g，雌雄各半，由浙江中医药大学实验动物中心提供，实验动物合格证号：SCXK（浙）2005-0021。所有动物Preyer反射正常，无耳疾。随机分为正常组、模型组、TMP组、针刺组、针刺+ TMP组，每组10只。

1.2 药品和试剂 盐酸川芎嗪：北京市燕京制药厂，批号：050701；硫酸庆大霉素注射液，每支2mL含GM 80mg，湖北天药药业股份有限公司生产，国药标字H42020030；MDA测定试剂盒，批号：20081105；TSOD测定试剂盒，批号：20081111。

1.3 电针及给药方法 正常对照组每天按2.5mL/kg剂量腹腔注射生理盐水，其余各组每天腹腔注射庆大霉素100mg/kg，连续14天；TMP组同时灌服川芎嗪200mg/kg；针刺组同时针刺双侧听宫、翳风、外关[4]（穴位参照文献报道的实验动物解剖学与人体穴位相应部位[5]），连续输出，刺激强度动物能忍受为度，持续刺激20min；TMP+针刺组先针刺双侧听宫、翳风、外关（方法同针刺组），针刺后立即灌服川芎嗪，剂量同TMP组；各组动物均连续针刺和（或）用药14天，每天测量体质量调整用药剂量，直至造模完成。根据ABR测定确定造模是否成功[2，6]。

1.4 ABR检测听反应阈 用药前及连续用药14天后的第1天检测双耳ABR。动物在戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉后，记录电极置颅顶正中，参考电极及接地电极分别置于给声耳及对侧耳后乳突部皮下。用ZEP型声刺激器，采用短声（click）刺激，扫描时间10ms，叠加512次，带通滤波100～3 000Hz，在屏蔽隔声室内常规测试。

1.5 耳蜗组织SOD活力和MDA含量测定 各组豚鼠停药后第一天测试。ABR后，迅速断头处死豚鼠取出听泡，蜗顶刺穿，在解剖显微镜下于0～4℃生理盐水中剔除蜗壳，将蜗轴连同膜蜗管取下，双耳合为一份标本放入离心管内。加入10倍体积生理盐水，用DLAX 900型匀浆机将上述组织研碎制成匀浆。4℃下离心10min（4 000r/min）后，分别取上清液0.1mL，应用黄嘌呤氧化酶法测定和硫代巴比妥酸法测定耳蜗组织中T-SOD活力和MDA含量。SOD活力单位

2 结 果

2.1 ABR检测听反应阈 治疗后正常组与模型组ABR阈值比较，差异有统计学意义（P＜0.01），显示造模成功，见表1。

表1 用药前后豚鼠ABR阈值比较（±s）

注：与用药前比较，△P＜0.01；与正常组比较，*P＜0.01

?

2.2 各组豚鼠血清MDA表达吸光值比较 正常组、各治疗组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），TMP+针刺组与其他组比较，差异有统计学意义（P＜0.01)；正常组与TMP组、针刺组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；针刺组与TMP组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 各组豚鼠血清MDA表达吸光值（±s）

注：与TMP+针刺组比较，▲P＜0.01；与模型组比较，☆P＜0.01

2.3 各组豚鼠血清SOD表达比较 模型组与正常组、针刺组及TMP+针刺组比较，差异有统计学意义（P＜0.01)；TMP组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；正常组与各治疗组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；各治疗组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组豚鼠血清SOD表达比较（±s）

注：与模型组比较，☆P＜0.01

组别n/只SOD正常组模型组TMP组针刺组TMP+针刺组10 10 10 10 10 131.33±4.06☆121.49±3.02 129.20±8.29 139.53±9.98☆166.57±9.42☆

3 讨 论

氨基糖苷类抗生素对听力损失的病理表现在耳蜗毛细胞破坏，尤其是外毛细胞最易受损。造成其损伤的毒性机制是细胞内线粒体蛋白质合成和氧自由基的形成障碍所致。氨基糖苷类抗生素可以通过激活一氧化氮合酶，增加一氧化氮的浓度，使内耳产生自由基。SODs是体内最主要和最常见的抗氧化系统，对机体氧化和抗平衡起着至关重要的作用，它可歧化超氧阴离子生成H2O2，从而消除其毒性，保护细胞免受损伤。因此，SOD间接反映了体内清除氧自由基的能力；MDA则是过多的氧自由基积累引发脂质过氧化作用形成的脂质过氧化物，它能造成神经细胞的裂变死亡。

Priuska等[7]报道GM可通过与铁形成GM-铁复合物而具有氧化还原活性，该复合物在体外和完整细胞内都能催生产生超氧阴离子，进而损伤毛细胞，导致听力障碍。本实验中，模型组SOD活性降低，MDA增加，提示GM中毒后，耳蜗内超氧阴离子增多，SOD活性降低，脂质氧化产物MDA增加，这也与陈贤明等[8]研究结论相一致。

川芎嗪是中药川芎的有效成分，化学结构为四甲基吡嗪（TMP），可通过血液、耳蜗外淋巴液及脑脊液三种途径直接作用于耳蜗和听神经。它可通过清除氧自由基及改善内耳血管纹循环，改善听力。崔城等报道[9]，中药川芎嗪可以改善庆大霉素中毒导致的感音神经性聋听觉功能。

本实验针刺选用听宫、翳风和外关穴三穴。听宫为近端取穴是手足少阳、手太阳经的会穴，是治疗耳聋的特效穴；翳风是手足少阳之会穴，针刺可起到改善局部血管营养和神经调节的作用。外关穴为手少阳络穴，又为八脉交会穴《针灸大成》“主耳聋，浑浑淳淳无闻，五指尽痛，不能握物”手足少阳经均“从耳后入耳，出走耳前”，手太阳经脉“却入耳中”，三穴合用有聪耳开窍之功效，可改善机体新陈代谢，激发细胞活性，从而增强药物在机体内的靶向效应[10]。

本实验结果显示，庆大霉素能引起组织内氧自由基的增多，SOD活性降低，MDA含量升高，各治疗组均能不同程度的拮抗庆大霉素的作用。治疗后除TMP组，其他各治疗组SOD的活性较模型组有明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；各治疗组MDA均明显降低，与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）；针刺配合川芎嗪组效果最佳（P＜0.01）。另外，笔者前期研究发现，针刺加川芎可通过抑制Bax蛋白表达，调节Bcl-2蛋白表达，而达到对耳蜗螺旋神经节细胞凋亡的调控作用[11]。由于Bcl-2蛋白存在线粒体内膜部位，这个部位又因多聚不饱和脂肪酸含量较多易被攻击而成为活性氧产生的主要场所。因此，Bcl-2具有抗氧化作用并可通过抑制活性氧形成而抑制细胞凋亡。据此我们可以推断，针刺加川芎对耳毒性保护存在多种相互关联的内在机制，可能通过增强Bcl-2表达，提高SOD活性，抑制自由基的产生，以对抗药物对耳神经所造成的损伤。

由此可见，针灸配合川芎嗪可以减少急性药物性聋豚鼠MDA的表达，增强SOD活性，从而抑制自由基生成，保护耳蜗免受损伤。

［1］王爱梅，汤浩，沈静，等.丹参注射液对庆大霉素耳中毒豚鼠耳蜗氧自由基生成的影响［J］.中国应用生理杂志，2004，20（4）：406-408.

［2］赵乌兰，王永华，王枫.针刺及川芎嗪对急性药物性聋豚鼠耳蜗生长相关蛋白GAP-43表达的影响［J］.浙江中医药大学学报，2008，32（6）：793-795.

［3］成泽东，陈以国.针刺对大鼠体内中药有效成分（TMP）趋向性影响的实验研究［J］.中国针灸，2002，22（1）：5133.

［4］付平，王顺金.针刺治疗对药物性耳聋病理形态学影响的实验研究［J］.北京针灸骨伤学院学报，1999，6（2）：7-8.

［5］李辞蓉，华兴邦，周浩良，等.豚鼠针灸穴位图谱的研制［J］.上海针灸杂志，1992，21（2）：28-31.

［6］郑华平，王枫，徐泉珍，等.针刺对川芎嗪防治豚鼠庆大霉素中毒性耳聋靶向作用的影响［J］.中国针灸，2008，28（7）：515-518.

［7］Priuska EM，Schacht J.Formation of free radicals by gentamicin and iron and evidence for an iron/gentamicin complex［J］.Biochem pharmacoi，1995，50：1749-1752.

［8］陈贤明.王锦玲，姜鸿彦,等.水杨酸钠降低庆大霉索所致耳蜗自由基含量的实验研究［J］.听力学及言语疾病杂志，2000，8（2）：68-70.

［9］崔城，汤浩，崔桂英，等.川芎嗪拮抗庆大霉素耳毒性作用的实验研究［J］.现代康复，2001，5（2）：53-54.

［10］郑华平，王枫，徐飞，等.针刺对川芎嗪防治豚鼠庆大霉素中毒性耳聋靶向作用的影响［J］.中国针灸，2008，28（7）：515-518.

［11］王永华,刘金洪，王枫，等.针刺及川芎嗪对庆大霉素致耳聋豚鼠螺旋神经节细胞凋亡及调控基因Bcl-2、Bax表达的影响［J］.中国中西医结合耳鼻喉科杂志，2007，15（5）：321-325.

Effects of Tetramethylpyrazine and Acupuncture on Cochlear Free Radical Expression of Piunea Pigs with AcuteDrug-induced Deafness

HAN Mingxun，ZHAO Wu
lan，WANG Yiming，et al.The Rehabilitation Institute For the Deaf ZJUTCM，Hangzhou(310053)，China

Objective：To investigate the effect of acupuncture and tetramethylpyrazine（TMP）on cochlear free radical expression of mice with acute drug-induced deafness.Methods：Fifty guinea pigs were randomly divided into 5 groups，including normal，model，TMP alone，acupuncture alone，and TMP plus acupuncture groups，10 animals in each group.Each group

different procedures.The normal group was prepared by consecutively intraperitoneal injection with normal saline of 2.5 mL/（kg·d）.Acute drug-induced deafness was made by consecutively in traperitoneal injection with gentamycin（100 mg/kg·d）in other groups.All groups were injected for consecutive 14 days.Before and 1 day after 14-day injection,the mice were tested ABR to identify whether the models were successful.The methods of thiobarbituric acid and xanthine oxidase were used to test serum malondialdehyde（MDA）and superoxide dismutase（T-SOD）.Results：The expression of MDA was reduced in all treatment groups as compared with that of the model group（P＜0.01），with the most reduction seen in the TMP plus acupuncture group.The activity of SOD was enhanced in all treatment group，but with no significant difference among the treatment groups（P＞0.05）.Conclusion：TMP plus acupuncture can effectively increase the activity of SOD and reduce the expression of MDA in the cochlear tissue.They may have effect against gentamycin-induced inner ear diseases.

piunea pigs drug-induced deafness tetramethylpyrazine acupuncture free radical formation

2013-07-02

国家自然基金面上项目（No.81173309）；浙江省中医药科技计划项目（No.2010ZA015）

王永华，Tel：13606626396；E-Mail：wangyh@vip.sina.com