肿瘤干细胞研究进展

胡博 孙鼎 徐泱

（1.复旦大学附属中山医院肝癌研究所，上海 200032；2.苏州大学附属第一医院，江苏苏州 215000）

干细胞是一群具有自我复制和向多种细胞分化能力的细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。在多种实体肿瘤中都存在少数具有干细胞特性即自我更新能力和多向分化潜能的细胞亚群，这种细胞亚群被称为肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC），其对肿瘤形成、复发、转移及化疗耐药性都有着重要影响。CSC假说不仅为研究肿瘤的发生发展和转移机制带来新的思路，在某种程度上还可能将颠覆肿瘤的传统治疗方法。

1 CSC概述

美国癌症研究协会2006年对CSC的定义为：肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。CSC假说于1977年首次提出，之后得到越来越多的研究支持与完善。1994年，Lapidot等［1］发现，只有0.1%～1.0%的白血病肿瘤细胞具有克隆生长的能力。1997年，Bonnet等［2］从急性髓性白血病患者的标本中成功分离得到CD34＋CD38＋细胞，并将其移植到非肥胖糖尿病／重度联合 免 疫 缺 陷 （nonobese diabetic／severe combined immune deficient，NOD／SCID）的小鼠骨髓中，导致小鼠发生急性髓性白血病。根据以上实验结果，研究人员推测血液干细胞是白血病转化的靶位，并提出白血病克隆（如正常血液细胞）是以等级方式排列的由大多数的不成熟细胞产生、功能进一步受限的分化细胞。2003年，Al－Hajj等［3］从乳腺癌肿瘤标本中分离出CD44＋／CD24－／Lin－／ESA＋细胞，并将其移植到NOD／SCID小鼠乳腺的脂肪垫中形成肿瘤，该研究首次证实了实体CSC的存在。CSC理论认为，肿瘤起源于少数具有自我更新能力和多向分化潜能的CSC，在众多实体瘤中皆有CSC存在的可能，目前这一观点得到了广泛认可。现已在血液系统肿瘤、脑肿瘤、乳腺癌肿瘤、前列腺癌肿瘤、结肠癌肿瘤、胰腺癌肿瘤等中证实了CSC的存在。

目前对肝癌的起源主要有两种假说：其一，癌变由肝脏干细胞的异常分化引起；其二，癌变由成熟肝细胞去分化所致。虽然对肝癌干细胞（liver cancer stem cells，LCSCs）的研究证据尚不能完全证实肝癌细胞中CSC的存在，但可以证实肝癌细胞中有一小群具有干细胞样潜能的肿瘤细胞，此类肝癌干／祖细胞样细胞在肝癌的形成、复发、转移及化疗耐药性方面都有着重要影响。虽然目前有多种LCSCs候选表面标志物可应用于LCSCs的分选及鉴定，但它们之中尚无国际公认的特异性高的标志物。

2 CSC的标志物

2.1 侧群细胞 侧群细胞是对小鼠骨髓造血干细胞进行检测时发现的，它能够通过细胞膜转运子（adenosine triphosphate－binding cassette，sub－family G，member 2，ABCG2）排出DNA荧光染料 Hoechst33342，目前在皮肤、肺、肝脏、心脏、脑、乳腺以及骨骼肌等组织中均可鉴别出来。由于侧群细胞具有自我更新、多向分化、克隆、药物抵抗以及体外致瘤等的CSC特性，所以可推测侧群细胞与CSC具有千丝万缕的联系，因而侧群细胞的分选有助于在不同肿瘤细胞系中鉴定CSC。尤文肉瘤侧群细胞SK－ES－1细胞株的克隆能力明显强于主群细胞［4］。此外，侧群细胞还具有很强的成瘤能力，1×103个侧群细胞就足以在NOD／SCID小鼠异体移植中形成肿瘤，而1×106个非侧群细胞也无法成瘤［5］。通过基因芯片进一步研究显示［6］，侧群细胞中多种干细胞基因表达上调，这些基因在维持干细胞表型和功能中起重要作用。由以上研究结果可以推测，侧群细胞就是人CSC。然而，研究显示，在无血清培养基中，仅C6侧群细胞具有体内成瘤能力，而在含血清培养基中，绝大多数C6细胞（包括侧群细胞与非侧群细胞）都表现出体内成瘤能力。究其原因，可能是由于荧光染料Hoechst33342的毒性会损伤非侧群细胞，导致其无法成瘤［7］。

2.2 CD133 CD133（prominin－1）是5跨膜蛋白家族的首个成员。1997年已证实CD133是造血干细胞的标志物，现其已被证实也是肝癌、脑胶质瘤、肺癌、肠癌、前列腺癌、胰腺癌、髓母细胞瘤及B16黑色素瘤等多种实体瘤干细胞的标志物。肝癌细胞中也存在CD133，研究发现从Huh－7肝癌细胞系中分离得到的CD133＋细胞与CD133－细胞相比，具有更强的体内、体外致瘤能力。将CD133＋与CD133－肝癌细胞分别植入SCID小鼠皮下，CD133－细胞无法成瘤。Nishina等［8］研究表明，在CD133＋细胞中，参与自我更新通路的“干性”基因的表达明显增高，与CD133－细胞相比，CD133＋细胞对传统化疗药物（如阿霉素和5－氟尿嘧啶）抵抗更甚，其潜在机制为CD133＋细胞通过激活Akt／PKB和Bcl－2通路使其具有耐药性。以上研究结果均支持CD133是LCSCs候选表面标志物。

然而，并不是所有CD133＋细胞都等同于CSC。Zhu等［9］异体移植实验证明，在CD133细胞中，并非CD133＋CD44－亚群具有高度致瘤能力。此外，由于 ATP结合子（ATP binding cassette，ABC）超家族转运子（包括ABCB1、ABCC1和ABCG2）上调，CD133＋CD44＋细胞具有干细胞相关基因的优先表达的特性，并对化疗药物更加耐药。Chen等［10］最新研究表明，与以往认识不同，胃肠道间质瘤中CD133和CD44的表达有可能仅代表一种细胞系而非肿瘤细胞标志物。但这一结论能否能推广到肝细胞癌中还需进一步研究。Ma等［11］还发现，CD133＋／ALDH＋细胞较 CD133－／ALDH－或CD133－／ALDH＋具有更强的体内、外成瘤能力。

2.3 上皮细胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM） EpCAM是肿瘤相关钙信号转导1基因编码的单次跨膜蛋白，其分子质量为30 000～40 000，参与细胞的粘附、迁移、增殖、分化等。1979年在结肠癌中首次发现EpCAM的存在。Yamashita等［12］认为，EpCAM＋的 HCC细胞具有肝癌干细胞样的自我更新和分化能力，因此具有作为候选LCSCs标志物的重要价值。除存在于正常成人肝细胞之外，EpCAM在胚胎肝母细胞、胆管上皮、肝干细胞、癌前病变肝组织的肝细胞及肝癌细胞中均高度表达。越来越多研究显示，EpCAM在细胞增殖、迁移及有丝分裂信号传导方面扮演着重要角色。肝癌EpCAM＋细胞比EpCAM－细胞具有更强的成瘤及侵袭能力［13］。Kimura等［14］研究结果表明，EpCAM＋与EpCAM－肝癌细胞群间存在本质的生物学差异，EpCAM＋细胞群包含CSC样的高度致瘤性细胞。Yamashita等［12］进一步证实，与EpCAM－AFP－（a－foetoprotein）肝癌细胞相比，Ep－CAM＋AFP＋肝癌细胞对门静脉侵犯更加常见，使患者生存时间明显缩短。由于EpCAM是 Wnt／βcatenin通路的靶基因，通过阻断 Wnt／β－catenin通路来抑制EpCAM＋肝癌细胞增殖，将为治疗肝癌提供新的思路。

2.4 卵圆细胞抗原（OV6） 肝卵圆细胞于1944年在大鼠化学诱导癌的生成过程中发现。1956年，Farber首次将其命名为卵圆细胞。其体积较小，细胞核占据大部分细胞质，呈卵圆形，细胞质嗜碱性且浅染，表现出未分化细胞的特点。卵圆细胞是肝脏的干细胞，具备多向分化潜能，体内外实验证实其可以分化为肝细胞、胆管细胞、胰腺及肠型上皮细胞。Yang等［15］研究表明，肝卵圆细胞能表达卵圆细胞特异标志物OV6，在SMMC－7721细胞系中CD133表达的细胞仅为0.12%，几乎都出现在OV6＋亚群细胞中，提示OV6＋可以作为肝癌干细胞的标志物。将OV6＋SMMC7721细胞植入NOD／SCID小鼠体内后，可以形成较大肿瘤，而OV6－细胞则不能或只能形成很小的肿瘤。此外，需要50～100倍于OV6＋的细胞浓度的OV6－细胞才能在NODSCID小鼠体内形成近似于OV6＋所形成的肿瘤大小。

2.5 CD90 CD90又称Thy－1，为免疫球蛋白超家族中的分子量最小的成员，是一种分子量为25 000～37 000的糖基磷脂酰肌醇锚定糖蛋白，主要表达于造血干细胞，并参与细胞与细胞、细胞与基质间的相互作用。Yang等［15］研究显示，CD90是肝癌CSC的候选标志物。从肝癌细胞系中分离的CD90＋细胞能促进免疫缺陷小鼠体内肿瘤的形成与转移。作为标志物，CD90在肝干／祖细胞、小鼠乳腺CSC以及原代培养的CD133＋胶质母细胞瘤表面均有表达。在所有肝癌标本及90%以上的肝癌患者血样本中分离得到的CD45－CD90＋细胞，均可在免疫缺陷小鼠体内成瘤，而CD45－CD90－则不能成瘤。进一步研究表明，CD90＋细胞能在免疫缺陷小鼠体内2次或3次成瘤，再次证明其可作为肝癌干细胞的标志物。抑制CD44可以诱导CD90＋细胞凋亡并抑制CD90＋细胞在免疫缺陷小鼠体内成瘤。因此，CD90为疾病监测提供了细胞标志物，CD44是未来根除肿瘤的潜在靶位。

3 CSC与信号通路

3.1 Wnt信号通路 Wnt信号通路是一条进化保守的信号转导通路，其成员主要包括：细胞外因子Wnt、跨膜受体、细胞质蛋白β－catenin、核内转录因子及下游靶基因。Wnt信号通路与CSC关系密切，任何环节发生异常都可导致该通路的持续激活并促进肿瘤的发生发展。研究发现，该通路的异常参与多个组织器官（如肝脏、结肠、乳腺、卵巢、皮肤等）肿瘤的形成。在乳腺癌中，某些Wnt因子的表达水平是正常水平的4～10倍。大约20%的晚期前列腺癌中存在β－catenin的核转移，5%～7%的前列腺癌出现β－catenin的基因突变。62%的宫颈癌变前组织及70%以上浸润型癌组织中有细胞质β－catenin的异常分布。目前已知的Wnt蛋白有19种，其在胃癌、结／直肠癌、黑色素瘤中表达上调，在小细胞肺癌中过度表达。

有30%～70%肝癌细胞中存在β－catenin的细胞核内或细胞质积聚［16］。Wnt信号通路可激活啮齿动物卵圆细胞和OV6＋致瘤性肝癌细胞［15］，并使EpCAM＋细胞数显著增加。应用RNA干扰试验阻断 Wnt／β－catenin信号靶点，能减弱上述细胞活化。Kim等［17］认为，EpCAM＋AFP＋肝癌细胞具有LCSCs的所有特性。研究发现，微小RNA－181s（miR－181s）家族参与EpCAM＋AFP＋CSC干细胞状态的维持。Wnt信号通路是miR－181s表达的重要转录调控途径。实验证明，阻断 Wnt／β－catenin信号通路有助于抑制肝细胞形成肿瘤。有趣的是，在不同组织中，大部分被用来分离、纯化CSC的细胞标志物（包括LGR5／GPR49、CD44、CD24和 Ep－CAM）都是Wnt信号通路的直接靶点。

3.2 Hippo信号通路 Hippo是一种丝氨酸／苏氨酸激酶，属于Ste20样激酶家族，它是因果蝇Ste20样激酶Hippo而得名。研究［18］发现，Hippo信号通路是哺乳动物细胞接触抑制细胞生长、增殖、凋亡以及肿瘤发生过程中的重要调控因子，该通路的核心组件及上游调节因子几乎都具有肿瘤抑制功能，而转录辅激活因子与PDZ结合序列、YAP及TEAD1～4几乎都参与致癌。以上任何因子的异常均可能导致肿瘤形成。YAP是Hippo通路的下游效应因子，在肝癌细胞中其表达显著增加。miR－375的靶位是YAP，YAP的表达增加与miR－375的下调有关［19］。

3.3 Notch信号通路 Notch信号转导通路由受体、配体和DNA结合蛋白三部分组成。在前列腺癌、乳腺癌、子宫颈癌等多种肿瘤细胞及其衍生的细胞系中均存在Notch受体及配体的异常表达，提示Notch信号通路在肿瘤细胞中处于活化状态，在CSC向肿瘤发展的过程中发挥重要作用。在乳腺癌CSC中，Notch4的活化表达是其他癌细胞的8倍，提示Notch4通路的异常可诱导乳腺CSC向乳腺癌干细胞转化［20］。Dontu等［21］发现，Notch信号激活DSL信号肽时，次级微球体增加10倍，表明Notch信号能作用于乳腺癌CSC并促进其自我更新。此外，Notch1的过表达能促进神经胶质瘤细胞SHG44细胞的生长，提示Notch信号还与人神经系统CSC的形成有关［22］。Notch1基因与多种信号转导通路如 Wnt／β－catenin、p21WAF1、p65等有交叉作用。

Notch信号通路在肝癌的发生、发展中具有重要作用。与CD133－肝癌细胞相比，CD133＋肝癌细胞中有更多参与Notch通路的基因得到表达。HBx可通过调控Notch受体的配体Jagged1来促进肝癌细胞的形成。Nishina等［23］发现，RUNX3的表达可以抑制Jagged1的表达，并通过抑制Jagged1－Notch信号通路抑制肿瘤发生，目前该抑制剂己处于肝癌治疗的临床试验阶段。

3.4 Hedgehog信号通路 Hedgehog（Hh）信号通路主要由分泌型糖蛋白配体Hedgehog、2个跨膜蛋白受体Ptch和Smo、下游转录因子Gli蛋白及下游靶基因如CCND1、CCND2、bcl－2等组成。Hh信号通路的过度活化是CSC形成与无限增殖的元凶之一。Hh信号通路在恶性肿瘤的形成、生长及维持方面具有重要作用。Sarkar等［24］研究发现，在髓母细胞瘤、基底细胞癌、小细胞肺癌、乳癌、胃癌、白血病、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤中存在Hh信号通路不规则激活。应用Hh通路特异性抑制剂环巴明后发现，内胚层起源的器官发生肿瘤需要Hh通路的参与。Hh信号通路的异常激活包括配体依赖的激活和配体非依赖的激活。配体依赖的激活是指配体如SHH（sonic hedgehog）、IHH（In－dian hedgehog）与受体Ptch1结合，诱导原癌基因Smo的激活，引起Hh信号通路的激活。该种激活方式可分为自分泌型和旁分泌型，前者指肿瘤细胞分泌Hh配体后又反作用于肿瘤细胞本身；后者又可分为IIIa和IIIb，通过肿瘤细胞与周围间质相互作用而激活。配体非依赖的激活主要指信号通路成员如Ptch1或Smo突变，最终导致Hh信号通路的激活。

Yilmaz等［25］通过实验发现，Hh通路抑制物GDC－0449，一种可以与Smo结合的小分子抑制物，能够抑制小鼠肝脏CD44＋细胞的积聚，促进肝内癌细胞的退化以及在不增加死亡率的同时减少转移性肝癌细胞的数量。这说明Hh通路的激活可以促进肝癌的形成，若能抑制该通路，即使是晚期肝癌，也可能被逆转。

正常干细胞与CSC具有许多相同的生物学特性。值得注意的是，由于一些信号通路，如 Wnt／βcatenin，Notch，Hedgehog，Bmi－1共存于正常干细胞及CSC内，针对这些通路的CSC靶向治疗将同时损伤正常干细胞。因此，为了减少上述风险，选择特异表达于CSC的信号通路十分重要。例如作为CSC标志物的EpCAM，在细胞增殖、迁移和有丝分裂信号转导中起重要作用，在正常细胞内Ep－CAM也显著表达。此外，在肿瘤发展过程中，Wnt信号通路起调控作用，同时其在维持正常组织内动态平衡中也扮演重要角色。因此，当以这些信号通路为靶位时，正常细胞的生理功能也将受到影响。然而，Yilmaz等［25］应用雷帕霉素抑制 Akt－mTOR通路活性，在不损伤正常干细胞的情况下，成功地消灭白血病干细胞并恢复了正常血液干细胞功能。因此，正常干细胞与CSC的特性的差异仍有待进一步阐明以提供新的治疗靶位。

4 CSC与肿瘤多药耐药

多药耐药性（multidrug resistance，MDR）是指肿瘤细胞接触化疗药物之后，不仅对该药产生了耐药性，还对其他结构及作用机制不同的药物也产生了耐药性。目前耐药性已成为肿瘤治疗过程中的最大障碍。许多体内、体外实验提示，MDR与CSC存在有关。肿瘤耐药性的机制可能与以下几方面有关。

4.1 表达ABC转运蛋白 ABC转运蛋白是一类跨膜蛋白，是多药耐药家族中重要的一员，在体内分布广泛，可转运肽类、内源性脂类、核苷酸、药物霉素等。目前研究较深入的ABC转运蛋白主要有ABCB1、ABCC1、ABCG2，它们利用ATP分解产生的能量主动将细胞内的药物泵出，降低细胞内药物浓度，从而保护自身免受细胞毒性药物的损伤。敲除ABCG2、ABCB1或ABCC1基因的小鼠对长春新碱、异阿凡曼菌素、米托蒽醌等药物更加敏感，提示ABC转运子可保护细胞免受化疗药物的影响。此外，表达ABC转运蛋白的Huh－7细胞对阿霉素表现出明显耐药性。ABC转运蛋白的上调与miRNA下调以及酪氨酸激酶途径中表皮生长因子的激活相关，这一发现为克服肿瘤的临床MDR带来了希望。

4.2 静止期或休眠期 一般而言，传统的肿瘤放、化疗以增殖细胞为靶向。然而CSCs通常处于静止期，很少进行分裂增殖，对传统治疗不敏感。Ricci－Vitiani等［26］进行体内功能测定结果显示，约96%的白血病患者CSC处于G0期。因标准化疗方案只对循环池中的成熟细胞有杀伤作用，处于G0期的白血病CSC不分裂，因而不能被药物完全杀死而残留下来。换言之，快速增殖细胞能够被抗肿瘤药物杀灭，而相对静止的CSC则逃逸治疗，一旦受到适当刺激便重新进入细胞分裂周期继续增殖并分化形成新的肿瘤细胞，导致肿瘤复发。

4.3 抗凋亡基因的高表达 诱导细胞凋亡是众多化疗药物杀伤肿瘤细胞的共同机制。bcl－2是一类新的癌基因家族，根据其结构和功能不同分为3个亚家族：抗凋亡蛋白亚家族（亚家族1），包括bcl－2、bcl－xl、bcl－w、Mcl－1、Al（BFl－1）；含多区域的促凋亡蛋白亚家族（亚家族2），包括Bax、Bak、Mtd（Bok）；仅含BH3区域的促凋亡蛋白亚家族（亚家族3），包括Bik（Nbk）、Bid、Bad、Bim（Bod）、Hrk等。抗凋亡基因的过度表达会使化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用转变为对细胞死亡的抑制而耐药。除bcl－2外，CSCs也持续表达一些其他的参与耐药抗凋亡基因，如死亡相关蛋白激酶（DAPK）。DAPK是一种钙调蛋白调节的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，负责启动程序性细胞死亡，其启动子区甲基化使基因转录沉默而失去功能，与肿瘤细胞的形成和转移有关。新近一项关于胃癌的研究结果表明，DAPK基因启动子甲基化在胃癌癌前病变和早期胃癌的发病机制中发挥着重要作用。

以CSC为靶向的治疗方式将成为治愈肿瘤的重要途径，但也面临着巨大挑战。研发一种可选择性根治CSC的手段，需要运用新技术以确定正常干细胞的功能、物理特性（如细胞表面抗原标志物），以利于对其进行筛选、分离。否则，将无法获知一个候选药物是否对正常干细胞也具有细胞毒性。同时，仍需研究CSC是如何从正常干细胞分化而来，特别是关于细胞生存调控和损伤后应答的机制。理想的治疗方法应该只针对CSC抵御外界刺激、维持其稳态的信号通路。此外，目前的治疗为何只能有效杀灭大部分肿瘤细胞却无法根除CSC，也仍有待进一步研究。

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