生长因子在泌尿系统组织工程中的可控释放策略研究进展

黄建文 综 述 徐月敏 校 审

生长因子在泌尿系统组织工程中的可控释放策略研究进展

黄建文 综 述 徐月敏 校 审

外源性生长因子在泌尿系统组织工程研究中具有重要作用，但由于生长因子半衰期短，越来越多的研究利用各种控制释放载体，使生长因子在体内以恒定的速率缓慢而持续地释放，以保证其在支架材料中的含量，从而促进组织再生。本文就生长因子在泌尿系统组织工程中的控制释放策略的最新进展进行综述。

生长因子组织工程泌尿系统可控释放

目前，泌尿系统的修复重建仍然是临床的难题之一，多采用自体组织移植，虽然效果尚可[1-2]，但是存在自身供区不足等问题。组织工程研究的进展，显示了其在泌尿系统修复重建中的良好的应用前景。

以有的研究表明，将种子细胞复合支架材料或单纯支架材料，用于部分膀胱或短段尿道的重建均能获得良好效果，但在大面积膀胱和长段尿道重建中存在支架萎缩、纤维化等现象[3-4]。局部血供不佳是导致该现象的重要原因。构建部位的供血不足，最终将导致构建组织的坏死、纤维化，影响组织和器官的修复重建。

众多的研究已明确了多种生长因子与血管形成相关，主要有血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维生长因子（b-FGF）、转化生长因子（TGF）、血小板源性生长因子（PDGF）等。这些生长因子通过直接或间接作用，可促进泌尿系统重建时的血管形成，还可促进平滑肌的增殖和神经的再生[5-6]。研究表明，虽然天然脱细胞生物支架材料中存在多种生长因子（如VEGF、b-FGF等），但在支架脱细胞处理过程会出现生长因子活性降低和数量减少，不能保证天然脱细胞支架中含有足够数量的活性生长因子[7-8]。因此，将外源性生长因子通过各种方法植入支架材料中，促进泌尿系组织的修复重建成为研究的重要方向。

外源性生长因子由于半衰期短、在体内扩散速度过快，难以在支架材料中持续保存，同时，扩散的生长因子会导致严重的副作用[9-10]。因此，越来越多的研究利用各种控制释放载体，使生长因子在体内以一个恒定的速率缓慢、持续释放，以保证其在支架材料中的含量，从而增加组织的再生。

1 细胞外基质（ECM）冻干、再水化作用

冻干是生物材料处理过程中一种较常用的方法，能使生物材料更易保存、消毒和转移[11]。冻干的生物材料在应用中应经过再水化处理，从而使得生长因子能更好地结合于生物材料。因为冻干状态的生物材料更容易吸收水溶液，但再水化后其所吸收的水溶液能抑制其它水溶液的吸收和渗透[12]。由于溶液状的生长因子往往不能获得理想的生物活性，因此，在生长因子的治疗应用中需要一种有效的装载系统，其中天然的细胞外基质（ECM）就是一种比较理想的装载体[13-14]。Kanematsu等[15]通过膀胱脱细胞基质（BAMG）与碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）再水化作用，将bFGF装载于冻干的BAMG中，在体内、外观察生长因子在支架中的释放情况。结果显示在复合支架植入老鼠皮下的4周内，bFGF缓慢释放，而直接注射至皮下的bFGF在2 d后即没有了bFGF的释放；同时发现，与冻干处理前的BAMG相比，冻干后的BAMG释放的bFGF更少。这表明相关生长因子最好与冻存后再次水化的支架材料进行复合，可以尽可能减少支架结构的破坏并能保护所复合的生长因子的活性[12]。

Kanematsu等[12]应用再水化作用对复合生长因子HGF、VEGF、PDGF-BB、IGF-1和HB-EGF-BAMG的支架进行研究。结果显示，所有生长因子均匀地分布在脱细胞基质中，从而防止了局部过高的生长因子浓度所导致的副作用；同时各种生长因子能伴随着生物材料的逐渐降解而持续地释放。所以，冻干的脱细胞基质能作为一种有效的、能提高生长因子活性的可控释放载体，能促进血管的再生。

2 构建胶原结合域（CBD）-生长因子变异体

胶原具有抗原性小、生物降解性和相容性良好等优点，在组织修复中得到广泛的应用[16]。为了提高胶原支架在组织修复中的作用，往往将外源性生长因子结合至胶原支架中[17]。但是，生长因子吸附至胶原支架中的方法无法满足组织修复的需要，因为生长因子快速扩散可导致活性降低或丧失[18]。所以，增加生长因子与支架的吸附能力，从而保持足够的浓度显得尤为重要。研究发现，7个氨基酸系列多肽（即胶原结合域）通过结合天然生长因子的N末端，能增加生长因子与胶原支架的黏附能力，从而防止生长因子的快速扩散，并维持合适的浓度。以往的研究表明，表皮生长因子、转化生长因子和碱性成纤维细胞生长因子通过来源于vWF的胶原肽修饰后，其组织修复效果优于天然的生长因子。但是这些研究仅强调了支架中生长因子的可控释放，缺乏组织再生的相关研究[19-23]。

Lin等[24]将来源于胶原酶的CBD（TKKTLRT）与血小板源性生长因子（PDGF-BB）的N末端结合，组成一种胶原靶向系统，能特异性地结合至胶原支架中，并能保持生长因子的活性；在体内，与天然的PDGF支架相比，CBD-PDGF支架具有更佳的促细胞化和血管再生的能力。

来源于vWF或胶原酶的CBD主要用于研究药物的可控释放，但经CBD修饰的生长因子在支架中的发挥效果还不明了。Zhao等[25]将两种来源不同的CBD引入至bFGF中。一种来源于vWF的CBD与bFGF结合（V-bFGF），另一种是来源于胶原酶的CBD与bFGF结合（C-bFGF），研究不同来源的CBD-bFGF在组织修复中的作用。结果显示，两种组合体都保留了生长因子的活性和结合胶原基质的特性。两种组合体在结合胶原基质、促血管化和细胞化的作用方面均优于天然的bFGF，但C-bFGF的作用优于V-bFGF。表明CBD结合bFGF是一种能促进伤口愈合和组织再生的靶向治疗系统；C-bFGF赋予bFGF更高的胶原亲和力，促进细胞化和血管化的作用优于v-bFGF。

研究认为，CBD-生长因子/胶原系统在膀胱再生中可能具有促进组织再生的作用。Chen等[26]应用CBD-bFGF/胶原支架修复部分切除后的小鼠膀胱，并观察修复术后膀胱组织和功能的修复情况。结果显示，术后90 d，在支架与周围膀胱组织的结合、支架的降解和细胞化、平滑肌再生和血管化、膀胱的顺应性等方面，CBD-FGF/胶原支架组优于FGF/胶原支架和PBS/胶原支架组。表明CBD-FGF/胶原支架能更好地促进膀胱的再生。膀胱的再生涉及多种生长因子，单一的生长因子不足以满足膀胱再生的需要[27]。所以促进膀胱再生的最佳生长因子、最佳剂量和最佳的生长因子载体系统需要更进一步的研究。

3 生长因子的基因治疗

由于外源性生长因子具有对热和化学处理敏感、半衰期短、难以控制其在支架中的分布等不足[28]。将外源性的生长因子基因导入目的细胞并有效表达，已引起广泛关注。

基因治疗需要合适的载体，目前研究较多的是逆转录病毒载体或腺病毒载体[28-29]。通过载体介导能表达生长因子蛋白的基因，并转染至种子细胞或支架中，使基因在局部持续、稳定、缓慢、高效表达生长因子蛋白，并且有利于生长因子浓度的精确维持，更好地调控组织的修复和再生。

为了研究VEGF基因修饰后对血管再生的作用，Lwaguro等[30]应用VEGF基因修饰的血管内皮祖细胞（EPC）改善肢体缺血动物模型中的血管生成。结果显示，VEGF基因修饰过的EPC能明显改善缺血组织的血液供应，且达到同样效果所需要的转基因EPC数量较未转基因的少30倍，提示联合VEGF基因的EPC治疗是一种更高效的促进血管再生的治疗模式。Chen等[31]将复合VEGF基因修饰EPC的膀胱脱细胞基质（BAMG）用于膀胱组织的构建，采用含VEGF基因的腺病毒载体转染自体外周血EPC，种植于同种异体猪BAMG，体外培养3 d后回植，结果显示BAMG对EPC无细胞毒性；组织工程膀胱的功能和组织学检查表明膀胱组织随时间延长逐渐再生；与对照组相比，VEGF基因-EPC/BAMG组的血管密度增加明显。

Guan等[29]借鉴VEGF在缺血性心肌病治疗中所取得的经验，应用VEGF165基因插入逆转录病毒载体pMSCV-GFP中，构建pMSCV-VEGF165-GFP载体，逆转录病毒载体转染膀胱尿路上皮细胞（UC）后种植于同种异体兔动脉脱细胞基质中，研究基因治疗在组织工程尿道中的应用。结果提示，基因修饰过的UC能同时表达VEGF和GFP蛋白，且细胞分泌VEGF呈时间依赖性；与仅以GFP修饰的细胞相比，VEGF修饰的UC增加血管形成更明显，同时形成的尿道上皮层更光滑、排列更规则，与正常尿道相似。

病毒载体具有潜在的致癌毒性和免疫原性，所以相关研究开始聚焦于非病毒载体。研究发现，非病毒转基因载体能够浓缩质粒，被细胞内吞并进入细胞核，从而使质粒表达基因产物[32]。林茂虎等[33-34]将VEGFl65 cDNA克隆于真核表达载体pcDNA3.1(-)，构建真核表达质粒载体pcDNA3.1(-)／VEGFl65，并转染入分离纯化的鼠膀胱平滑肌细胞内。结果显示，pcDNA3.1(-)/VEGF165转染入鼠膀胱平滑肌细胞后，VEGF的表达增高，转染后细胞上清液具有促使内皮细胞增殖的生物学活性。将平滑肌细胞植入小鼠体内，并以膀胱缺损自然愈合和单纯植入小肠黏膜下组织（SIS）为对照进行观察，发现术后2周转染VEGF组中新生毛细血管数量和VEGF受体的阳性表达细胞数高于单纯SIS植入组。

4 纳米或微米载体技术

随着纳米和微米技术在医学应用中的发展，纳米和微米载体为外源性生长因子的可控释放和活性保护提供了新的思路。该技术作为药物的一种新型缓释系统，常采用微球或微囊的形式，具有明显的优势：①可以实现生长因子的长期释放，可控性强[35-36]；②可以实现多种生长因子的同时或顺序释放[37-38]；③可使外源性生长因子具有长期生物活性[39]。同时，纳米和微米载体无免疫源性和毒性，具备较高的转移效率。所以，纳米和微米载体技术在骨骼、软骨、皮肤、心瓣膜、血管和神经等组织的修复重建研究中应用广泛。

Geng等[39]为了实现VEGF的长期持续释放，制备了一种新型的VEGF-纳米微球-热敏感性水凝胶系统，并将该系统植入BAMG内。通过体内、体外研究，研究者发现纳米微球包裹的VEGF的生物活性得以保持，持续释放时间超过60 d，未出现急性组织反应、炎症和毒性反应。该新型生长因子释放系统可能为泌尿系修复重建提供了一种前景良好的手段。

5 其它

有研究报道,生物活性因子通过来源于α2-纤溶酶抑制剂的肽段能共价结合至纤维蛋白基质中[40]。因此，Lorentz等[41]将α2-纤溶酶抑制剂的8个氨基酸系列（α2PⅡ-8）结合胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的N末端，形成变异体α2PⅡ-8-IGF-1，在凝血酶/XⅢa调控聚合反应时变异体共价结合在纤维蛋白基质中，评估α2PⅡ-8修饰的IGF-1在促进膀胱平滑肌再生中的作用。结果显示，与天然IGF组相比，变异体α2PⅡ-8-IGF-1组更能促进膀胱平滑肌细胞的增殖，表明α2PⅡ-8-IGF/纤维蛋白基质能作为一种IGF的储存体，延长IGF在基质内的储存期，从而提高细胞增殖反应，为促进组织再生提供另一种有效选择。

硫酸化氨基聚糖（GAG）通过与外源性生长因子的结合，可以作为生长因子在生物支架中的储存体，增强生长因子在膀胱组织工程中的应用[42-43]。因此，研究GAG与外源性生长因子一起加入生物支架内，以促进组织的再生成为当前的研究热点。

Loai等[44]应用透明质酸（HA）与VEGF结合至BAMG中，评估HA-VEGF-BAMG在膀胱组织工程中的作用。在促进膀胱组织再生和血管形成方面，HA-VEGF-BAMG组优于BAMG组和HA-BAMG组、HA-BAMG组优于BAMG组。HA作为GAG家族中的一员，不仅能降低支架的孔隙率和炎症反应，而且具有高黏附性。所以，HA能作为生长因子的载体，有利于促进生长因子在组织再生中的作用。

6 问题与展望

综上所述，外源性生长因子通过多种方式保持其持续、缓慢地释放，有效地促进泌尿系组织、器官的再生和血管形成。但目前生长因子可控释放的研究主要集中在短段尿道或部分膀胱修复重建中，尚不能保证这些可控释放方式能满足长段尿道或大面积膀胱缺损的组织再生需要。所以，保证生长因子释放与组织修复的时间一致性尤为重要。同时，目前研究者主要研究单一生长因子在泌尿系组织修复重建中的作用，而正常组织再生往往需要在多种因子的相互作用下完成。所以，具有可以控制多种因子同时或顺序释放的可控性强的纳米和微米载体技术有望成为极具前途的组织工程大面积缺损重建的重要技术。

促进外源性生长因子持续、缓慢、高表达的基因治疗手段在泌尿系组织工程修复重建中具有重要的作用，但由于基因治疗本身存在一些问题，如可控性差、致肿瘤性等。所以，基因治疗需要进一步改进。如微囊化基因治疗技术就是一种新的促进移植组织血管化和组织修复重建的手段[45]，但这方面的研究还在探索中，尚需更进一步的研究。

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The Strategy of Controlled Release for Growth Factors in Urinary System Tissue Engineering

HUANG Jianwen,XU

Yueming.Department of Urology,Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University Shool of Medicine, Shanghai 200233,China.Corresponding author:XU Yuemin(E-mail:xuyuemin@263.net).

【Summary】The exogenous growth factors play an important role in urinary system tissue engineering.However,because of the short half-life of growth factors,several release vehicles were studied to make growth factors release slowly and to keep suitable content in scaffold and improve tissue regeneration.This review covered the current research development in the strategy of controlled release of growth factors in urinary system tissue engineering.

Growth factors;Tissue engineering;Urinary system;Controlled release

Q813.1+2

B

1673－0364（2013）03－0173－04

2013年1月30日；

2013年3月16日）

200233上海市上海交通大学医学院附属第六人民医院泌尿外科。

徐月敏（E-mail：xuyuemin@263.net）。

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.03.016