结直肠癌外周血循环肿瘤细胞的研究进展

周剑 王锡山

我国结直肠癌发病率居恶性肿瘤中第3位，且以每年4．2%的速度上升，5年生存率约为27%［1］。结直肠癌患者中早期诊断的患者仅约11%左右［2］，大多数患者在就诊时已经出现远期转移。肿瘤转移是一个涉及多步骤多因素的复杂过程，具有转移潜能的肿瘤细胞脱离原发病灶，以极少的数量转移到血液、骨髓、淋巴结或远处器官中，运用常规的检测手段难以发现，这种现象称为肿瘤的微转移(Micrometastasis)。肿瘤细胞的脱落、侵袭并进入血液循环是肿瘤转移的最初阶段，并为最终形成肿瘤转移病灶提供了可能。因此，在外周血中检测循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)逐渐成为临床研究的热点。本文就CTC在结直肠癌的检测、应用及新的研究方向等方面进行综述。

一、CTC概述

1869年，澳大利亚病理学家Ashworth在一例肿瘤患者的外周血中观测到肿瘤细胞，认为其为引起肿瘤转移的原因之一，并首次提出了循环肿瘤细胞的概念。CTC的定义是:外周血中由肿瘤原发灶或转移灶释放入血、具有肿瘤特异性抗原或基因特征的肿瘤细胞。现今人们已在包括结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、食管癌等类型的肿瘤中发现了CTC［3］。CTC的发现，对肿瘤转移机制研究及肿瘤诊疗有重大的意义。通过研究CTC可以发现肿瘤转移过程中的微妙变化，并能为患者的预后判断、病情评估及治疗反应等方面提供参考。

二、CTC的形成与肿瘤转移

CTC是指由实体肿瘤组织脱落并释放进入外周血循环的肿瘤细胞。获得高侵袭性表型的原发灶肿瘤细胞，侵犯周围基质并进入血液循环，成为CTC。离开血液循环，进入继发脏器的局部微环境，逃脱机体的免疫监视，到达远处脏器，存活并发生克隆增殖。如其能获得充足的血供，最终将形成肉眼可见的肿瘤转移灶。CTC也可向骨髓归巢，进入骨髓储备池并维持静息状态，在一定条件下可再次释放入外周血循环，活化增殖形成远处转移灶［4］。CTC与肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)间的关系已被众多研究所证实［5］。CTC具有CSC的高度侵袭性和转移潜能，此外上皮-间充质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)也是其生物学特征之一。肿瘤组织可招募一系列的基质细胞，通过分泌大量细胞因子和趋化因子等，使邻近细胞分化为诱导型肿瘤干细胞，获得转移潜能。部分具有高侵袭能力的CTC即来源于这些发生EMT的细胞。在此过程中，一系列的EMT靶基因受到调控，上皮细胞的标志物如钙黏蛋白、细胞角蛋白(cytokeratin，CK)等表达下调。同时，间充质细胞的标志物如弹性蛋白、基质金属蛋白酶等表达显著上调。这些标志物表达含量的改变，意味着仅用上皮细胞的表面标志物来定义CTC将会遗漏发生EMT的细胞，而该群细胞往往是CTC中最具有高度侵袭性和转移潜能的亚群。

三、结直肠癌CTC检测的方法

1．免疫细胞化学(immunocytochemistry，ICC)法:ICC 是基于抗原抗体结合反应的原理，将特异性的肿瘤标志物与单克隆抗体相结合，通过酶与底物反应显色或其他显色方法对肿瘤进行定位、定性和定量测定的技术。ICC的优点是简便、直观并可进行细胞大小与形态学分析，把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。缺点是:(1)敏感性低，只能从105个正常细胞中发现一个肿瘤细胞，而且肿瘤细胞表面抗原表达的不均一性，也在一定程度上降低了检测的敏感性［6］。(2)许多分化差的肿瘤细胞不能表达目标抗原、部分淋巴细胞交叉反应等因素都会影响CTC检测的特异性。(3)检测的肿瘤细胞抗原较高的表达丰度，而且镜下对结果的观察和判读主观性较强，限制了ICC在结直肠癌循环肿瘤细胞检测中的应用。所以目前较少单独应用传统的ICC方法检测结直肠癌外周血循环肿瘤细胞。有学者提出用磁性细胞分选技术或密度梯度离心法对肿瘤细胞进行富集后再用ICC检测，目的是为了提高ICC检测的敏感性和特异性。由此看出，磁性细胞分选技术与ICC相结合可以弥补技术上的不足，提高了CTC检测的敏感性和特异性。

2流式细胞术(flow cytometry，FCM):FCM是一项集计算机技术、激光、电子物理、流体动力学、细胞荧光化学、单克隆抗体等方法为一体的新型技术，该技术主要是运用标记荧光物质的单克隆抗体与肿瘤细胞特异性的标志物结合，使肿瘤细胞染色，然后用流式细胞仪进行测量分析［7］。FCM的优点主要是可在免疫放大检测CTC的同时对癌细胞的形态进行定量测定，可以提供DNA倍数性的关系，而且测量速度较快，检测数据较精确。同时，FCM还可进行多参数测量，并可对细胞进行分析与分选。流式细胞术检测结直肠癌循环肿瘤细胞需要将针对肿瘤细胞标志物的单克隆抗体结合荧光物质(如异硫氰酸荧光素)等使肿瘤细胞染色，然后用流式细胞仪进行分析，着色细胞即被视为阳性。Cohen等［8］人在研究结直肠癌患者时，利用FCM技术在每7．5ml血液中检测出2个CTC，而且结果显示CTC的检出率与病理分期有显著的相关性，这对结直肠癌微转移的诊断具有一定的临床意义。同时，Cohen发现，CTC在治疗前后数目的变化与影像学联合应用也可以作为判断结直肠癌转移的重要因素。FCM在CTC检测方面的局限性:(1)缺乏规范的操作方法，价格昂贵且时间较长，不同文献报道的流式细胞术检测循环肿瘤细胞的结果差异很大。(2)标本固定贮存及研究人员间的差异因素的干扰。(3)FCM的敏感性较低。检测肿瘤细胞的价值在很大程度上依赖于可分析的细胞数量［9］。FCM检测靶细胞的敏感度仅为1×104，而外周血中肿瘤细胞数量常少于1×106，因此受筛检细胞数的限制，单纯依靠FCM检测微转移的方法有一定的局限性，而主要用于骨髓微转移的检测和有明显转移的进展期患者外周血的肿瘤细胞的检测［10］。有文献指出，将FCM与其他细胞富集技术联用可对CTC进行特异性富集，提高方法的敏感性和鉴别力，可使CTC的检出率更高［11］。

3．免疫磁珠分离检测法:免疫磁珠分离技术(immunomagnetic separation，IMS)是近年来国内外研究的一种新的免疫学技术，它能够从大量外周血中筛选出带有特异性标记的肿瘤细胞。免疫磁珠是均匀的、球状的、具有超顺磁性及保护壳的微粒。其基本原理主要是细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，形成抗原－抗体－磁珠免疫复合物，该复合物在外加磁场的作用下发生力学移动，将含有靶抗原的目的细胞与其他细胞分离，从而达到特异性分离细胞的目的［12］。该方法的优点在于分选过程中避免了细胞溶解，降低了后续鉴定工作中的干扰因素，并可对细胞进行计数、染色、核酸分析以及药物敏感实验。免疫磁珠分离技术包括阳性分选和阴性分选两种方法。阳性分选即与磁珠结合的细胞就是所要分离获得的靶细胞;阴性分选则利用免疫磁珠去除无关细胞，游离于上清液的细胞为所需细胞。在试验中，技术人员多将阳性分选与阴性分选相结合以进一步降低血细胞的含量，提高富集效率。有报道称该技术的富集效率与一般的分离方法相比可提高1×103～1×104倍［13］。有研究人员将免疫磁珠与免疫细胞化学、RT-PCR、流式细胞术等方法相联合起来检测CTC，大大弥补了这些检测技术所存在的缺陷，提高了这些检测技术的敏感性和特异性。实验证明IMS与上述方法联合后提高了灵敏度和特异性，而且方便快捷，同时提高了癌细胞的检测率，将可能有助于早期肿瘤患者微转移的发现、术后患者肿瘤复发与转移的检测、预后评估、治疗策略的选择以及临床分期的重新确定［14］。但该技术在富集CTC的有效率以及检测微转移的研究中仍存在一些问题，例如受试者的炎症性疾病、组织创伤、样本中非肿瘤标志物的表达以及手术干预、采血时的操作都会得出假阳性的结果;而分离过程中CTC的丢失、循环中的肿瘤细胞的高度异质性等因素则会造成假阴性的结果。

4．cellsearch系统:cellsearch系统是惟一被美国美国食品药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准用于临床检测CTC的技术，是目前自动化程度最高的CTC检测技术。受人为因素影响较小，该系统集免疫磁珠富集技术和免疫荧光技术于一体，具有较高的特异性、敏感性及可重复性，是基于免疫学原理的检测方法。首先，cellsearch系统利用EPCAM抗体磁珠富集CTC，然后在外加磁场的作用下对血液中提取、分离出来的CTC进行通透、固定，再用DAPI荧光核染料、CD45荧光抗体和CK8、CK18以及CK19荧光抗体标记细胞，最后采用半自动四色荧光显微镜Cell-Spotter Analyzer检测分析［15］。系统的这种半自动特征使得样本的检测非常迅速，而且具有很好的重复性。cellsearch系统所需的血液样本在含有一种特殊防腐剂的试管中存放72h后，仍能检测到精确的CTC数目，表明该方法的敏感性很高，而且只需7．5ml血液样本，即可从400多亿血细胞中检测到一个CTC［16］。刘志东等［17］研究发现外周血CTC的存在可被视为肿瘤TNM分期的MX状态，作为精确临床分期的必要补充，有利于对患者的预后作出更准确的预测。Sastre等［18］使用cellsearch系统检测大肠癌患者CTC，结果显示CTC阳性(CTC≥2个)率与原发肿瘤部位、癌胚抗原、乳酸脱氢酶升高水平及肿瘤分化程度无关，但与结肠癌的临床分期有关，且CTC在结肠癌的早期阶段即可检测到，表明CTC检测有助于早期发现结肠癌及可能出现的微转移。然而，cellsearch系统操作步骤繁琐，技术要求高，价格昂贵，并且只能检测出EPCAM抗体阳性的CTC。因此，目前仍没有大规模的应用于临床。

5．聚合酶链反应:(polymerase chain reaction，PCR)主要是通过检测癌基因、抑癌基因的突变或染色体重排产生的异常DNA。此方法虽然敏感性高，但易出现假阳性，且适用范围比较有限。此外，由于外周血中的CTC和核酸的半衰期不稳定，检测到的游离DNA可能仅仅是核酸而非真正的肿瘤细胞。因此应用PCR技术通过DNA标记指标检测CTC的特异性不高，在临床实践中尚不能达到理想的效果［19］。

6．逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR):此技术以肿瘤和上皮组织中某种物质的mRNA为标志物检测结直肠癌循环肿瘤细胞。RT-PCR及其各种改进的技术目前在循环肿瘤细胞的检测中应用最广泛，且被认为是目前检测循环肿瘤细胞最有效的方法。RT-PCR检测CTC是在PCR的基础上扩增由肿瘤特异性mRNA序列逆转录的DNA片段，从而识别组织或肿瘤特异性mRNA的表达或某些基因改变后RNA水平的异常。由于这些特异性mRNA通常不表达于正常外周血细胞，且半衰期较短，在细胞死亡后会迅速被RNA酶降解，因此在外周血中检测到的这些特异性mRNA可以间接提示CTC的存在［20］。

7．光纤阵列扫描技术法:此方法将外周血的细胞固定于玻片，无需进行CTC富集纯化，采用自动化数字显微镜以30万个细胞/s的速度进行高速扫描，在玻片上直接定位经荧光探针标记的肿瘤细胞。该法具有高通量、高灵敏度的优点。由于其探针也采用上皮细胞标记，故同样无法鉴定出EMT 的肿瘤细胞［21］。

四、CTC与结直肠癌手术的关系

手术操作的影响会影响患者术后早期CTC数目，此时的CTC数目不具有预后意义［22］。如果术后1周CTC仍存在，则成为术后复发的危险信号［23］。CTC既可来源于肿瘤原发灶、转移灶，又可来自微转移灶［24］。有报道称进行经直肠超声检查可使结直肠癌患者的CTC水平较检查前升高，且这一部分患者预后较差［25］，提示超声探头对肿瘤的挤压，可能会促进肿瘤细胞向外周血扩散。由此联想到肠镜、结肠三维重建CT、盆腔核磁等应用结直肠癌定位、定性诊断中同样存在肿瘤细胞脱落的可能性。由此可见在对结直肠癌患者进行各种诊疗操作时，应注意避免肿瘤细胞的医源性血液播散［26］。

五、CTC在结直肠癌化疗中的作用

CTC可作为患者化疗敏感性的指标之一，CTC的持续存在常常提示肿瘤对化疗不敏感，CTC在患者化疗过程中的变化，是决定患者化疗敏感性及预后的因素之一，可作为结直肠癌患者个体化治疗的一个参考［27}。

六、CTC与结直肠癌患者预后的关系

随着结直肠癌患者的疾病进展，CTC阳性率逐渐增加［28}。外周血中CTC的数目与患者的5年生存率成反比关系，并且是结直肠癌患者远处转移以及预后的独立危险因素，可用于判断出现术后复发的风险［29］。与常规的肿瘤标记物(CEA/CA199)相比，CTC对结直肠癌患者发生远处转移的警示要比CEA早大约12个月。

七、直肠癌CTC检测的临床意义

现今结直肠癌的临床分期主要是依据TNM和Dukes分期标准，并不包括外周循环中的肿瘤细胞。一般认为，结直肠癌在转移的形成过程中，肿瘤细胞在到达远处器官之前必先在血液中循环。虽然并非所有循环中的癌细胞均能存活，但循环性癌细胞与肿瘤患者的复发和不良预后密切相关。因此，检测结直肠癌患者的循环肿瘤细胞的状态，可以作为现有的肿瘤临床分期方法的补充，从而精确肿瘤分期，更准确判断预后。检测结直肠癌患者循环肿瘤细胞的状态可以区别部分早期患者，采取针对性的治疗措施［30］。

综上所述，大量研究证实CTC与结直肠癌复发和转移密切相关，检测CTC有助于结直肠癌转移的早期诊断、临床分期、疗效监测及预后判断，并为结直肠癌患者个体化治疗提供临床指导。当然还存在很多争议。(1)目前尚未发现特异性非常高的肿瘤标志物。(2)CTC在循环中释放是随机的还是具有周期性和规律性。(3)缺乏有效的收集方法，因此会对收集的有效性和科学性造成影响，进而可直接到影响结果的可信度。(4)众多的检测方法均缺乏公认的检测标志、鉴定方法，尚无统一的规范。笔者认为同一检测方法，需保证患者准备、标本采集、样本处理的标准化，保证检测结果稳定可靠。不同检测方法间，应开展比对，并及时进行结果分析。CTC检测技术的不断发展和改进，将有助于我们更深入的了解结直肠癌的生物学性征，动态分析肿瘤分子的特性，更加及时、更加有效和更加完善的改善患者的预后，提高患者的生存率，为真正个体化治疗提供依据。

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