结直肠癌转移复发的转化医学研究

郑树

转化医学研究的过程是以患者为中心、以临床问题为导向、以成果应用为目标而进行的基础研究，是多层次、多学科交叉融合的系统研究工程［1］。近十余年来，结直肠癌基础研究及临床诊治方面有了很大进展，但其总生存率仍有待提高。转移复发是肿瘤治疗失败最主要原因，并直接影响预后。结直肠癌转移复发决定于肿瘤本身的生物学特征，包括病理类型和分期等。然而，同一形态、类型或分期的患者经同一治疗方案治疗后往往效果迥异，预后不一。如能够结合分子水平的分类、分型或分期将更精准的体现其客观生物学特征。如何对结直肠癌进行精准的分子分型是当前结直肠癌在转化医学研究所面临的重要问题，也是判断或预测转移复发及预后相关分子事件研究的重要方面。研究结直肠癌转移复发相关分子事件包括上皮间质转化(epithelialmesenchymal transition，EMT)及间质上皮转化(mesenchymal-epithelial transition，MET)的系统研究。以结直肠癌转移复发预测为目标的转化医学研究基本过程归纳如下:

一、发掘(discovery)

首先是发现或发掘相关标志物。可根据不同临床病理表型的组织样本，如有肝转移及无肝转移的结直肠癌原发灶，对比二者基因表达谱中存在明显差异的基因。此类研究如，经基因表达谱芯片筛选［1］在有转移的原发灶发现高表达的骨桥蛋白(osteopontin)及显著低表达的Spacr L1，这两个基因在表达量上显然与转移浸润相关，可能为结直肠癌肝转移的标志物，这两个基因必然与预后相关。

二、鉴定(identification)

第二步需证明发现的基因在结直肠癌细胞中存在、表达程度和相关功能，包括高不同表达水平对EMT-MET相关变化的影响，包括细胞增殖、生长曲线、细胞周期、细胞凋亡以及与转移相关的迁移、浸润等。明确基因的功能，同时在动物实验模型中鉴定研究该基因表达对小鼠移植瘤转移的影响。

三、证实(verification)

发现及鉴定的基因在临床是否可预测肿瘤的转移、复发和预后，或是否可作为干预阻断的候选靶点，这些需要进一步证实。为此，要应用一定数量的人体样本或病理组织腊块标本，并结合临床病理信息，包括治疗后的随访资料。分析该基因与生存率和复发率的相关性，进而证实其对临床预测的意义。

四、确认(validation)

该基因作为结直肠癌转移复发标志物的临床应用可行性、实用价值与实际意义需要进一步确认。为此，应开展多中心大样本试验。以同一方法检测分析，以验证及确认该标志物的意义，进而可推广应用。

转化医学研究源于临床需求，亦回馈服务于临床，是基础与临床紧密结合的系统工程。转化医学研究不仅需具备基础研究的可靠技术手段和实验设备，以准确提供精确反映肿瘤生物特征与功能的分子表型的结果，同时要求规范的临床病理诊断，不可或缺的生物组织样本库，规范的长期患者随访资料，以及高质量研究机构间的多中心合作，这样结论才会具有临床指导价值。

现列举以下已发表的几组资料供同道们参考:

1．SPARCL1基因:该基因是细胞外基质中的一种糖蛋白，与细胞粘附增殖有关。在很多正常组织中有较高表达。Hu等［2］从有、无肝转移的两组结直肠癌原发灶基因表达谱中筛选出有明显差异的基因，发现SPARCL1基因在无肝转移的结直肠癌原发灶中明显高表达，而在有肝转移的结直肠癌中明显表达低。作者经qRT-PCR和人体样本免疫组化鉴定均确定无转移原发灶表达明显高于有转移的结直肠癌(P＜0．05)，在肿瘤分化差结直肠癌蛋白表达低或无，在肿瘤分化好的结直肠癌蛋白表达明显较高。经功能研究，明确了SPARCL1抑制肠癌RKO细胞的侵袭、移动及穿透能力，小鼠体内试验证实该基因抑制体内成瘤及肝转移(P＜0．009)。从基因表达水平(qRT-PCR)及蛋白水平(western blot)均发现与EMT相关。SPARCL1表达增高与E-cadherin表达增高、Vimentin及N-cadherin表达降低明显相关。RKO及SW620细胞转染高表达SPARCL1或加入该蛋白，均可见细胞有EMT和MET腺管样形态(图1)。SPARCL1基因功能鉴定后，虞舒静等［3］分析了1999年至2004年随访36个月的156例大肠癌组织标本，以免疫组织化学法检测SPARCL1表达水平。将从低到高表达水平依次设为0～3，发现高表达SPARCL1的结直肠癌患者的生存率明显高于低表达患者(P=0．043)(图2)，从临床单中心病例证实了该基因可做为预测结直肠癌患者预后的标志物，但仍需进一步确认。2011年，中美两大癌症研究中心对SPARCL1基因进行了双中心大样本对比分析。两组对比分别从各自生物样本库(浙江大学肿瘤研究所412例，美国希望城医学中心222例)取结直肠癌样本进行确认。分析结果确认SPARCL1基因表达高者预后较好(图3)。

图1 SW620及RKO细胞转入SPARCL1或培养液中加入该蛋白的光镜下观察图像，显示细胞排列呈腺管样形态(MET ×10)

图2 免疫组织化学检测SPARCL1蛋白表达强度分层分析，显示SPARCL1蛋白高表达者生存率明显高于低表达者。

2．SOX2基因:该基因是一个重要的干细胞标志物，与肿瘤的发生发展极为相关，但与肿瘤转移、浸润以及在EMT-MET转化中的作用尚无人报道。Han等［4］进行了体内外研究，敲除结直肠癌SW620细胞的SOX2基因，结果发现SW620细胞由EMT转向MET，细胞转移浸润功能明显减弱。作者为证实SOX2基因表达在结直肠癌中的意义，对44例结直肠癌组织石腊标本进行免疫组化(IHC)检测，以观察SOX2蛋白表达。结果发现44例结直肠癌中阳性表达者有9例，其中7例有肝转移(77．8%)，8例淋巴结转移(88．8%)。而 SOX2阴性者分别为40．0%(14/35，P=0．029)及 51．4%(18/35，P=0．039)。从分期看，T1～2期肿瘤患者，SOX2表达均为阴性。9例SOX2表达阳性者均为T3～4(P=0．0006)。说明从对临床样本的研究中也体现SOX2与转移浸润相关。从预测预后的分子标志物角度看，SOX2基因研究尚缺乏足够的具有完整随访生存率病例的证实与确认，但该发现说明了SOX2与转移浸润相关并具有促EMT的作用，这为做进一步证实与确认提供了基础。

图3 两组生物样本库SPARCL1表达与相关因素分析情况

MGA2基因 该基因为核苷酸还原酶小亚基M2，其过度表达会促进肿瘤增殖及浸润。经美国希望城医学中心217例肠癌患者及浙江大学肿瘤研究所220例肠癌患者验证［5］，证实高表达者在两大组中总生存期和无病生存期均明显降低，其相对危险度在希望城组和浙江大学组分别为1．88和2．06。多因素分析提示错配修复基因缺失者风险度明显增加，如在希望城组达12．2。显然，HMGA2基因是预测预后的独立因素。

总之，结直肠癌转移复发的转化医学研究最终是为临床服务，目标在于解决临床需要。规范样本的取用和检测，开展多中心协作，在大数量的标本中确认与临床的关系，这些是必须的。我国人口众多，人群生物组织样本资源较为丰富，但需注意收集与保存。临床标本的合理利用应引起足够的关注与重视。

［1］ 郑树，黄彦钦，董琦，等．结直肠癌的转化医学研究．中华胃肠外科杂志，2013，16(1):4-7．

［2］ Hu H，Zhang H，Ge W，et al．Secreted protein acidic and rich in cysteines-like 1 suppresses aggressiveness and predicts better survival in colorectal cancers．Clin Cancer Res，2012，18(19):5438-5448．

［3］ Yu SJ，Yu JK，Ge WT，et al．SPARCL1，Shp2，MSH2，E-cadherin，p53，ADCY-2 and MAPK are prognosis-related in colorectal cancer．World J Gastroentero，2011，17(15):2028-2036．

［4］ Han X，Fang X，Lou X，et al．Silencing SOX2 induced mesenchymal-epithelial transition and its expression predicts liver and lymph node metastasis of CRC patients．PLoS One，2012，7(8):e41335．

［5］ Wang X，Liu X，Li AY，et al．Overexpression of HMGA2 promotes metastasis and impacts survival of colorectal cancers．Clin Cancer Res，2011，17(8):2570-2580．

郑树．结直肠癌转移复发的转化医学研究［J/CD］．中华结直肠疾病电子杂志，2013，2(1):2-5．