大黄中不同活性成分的综合实验

刘小花，胡芳弟，李 文，封士兰，南旭文，王海晴

（1.兰州大学药学院，甘肃兰州 730000；2.兰州大学药学院本科09级，甘肃兰州 730000）

大黄中不同活性成分的综合实验

刘小花1，胡芳弟1，李 文1，封士兰1，南旭文2，王海晴2

（1.兰州大学药学院，甘肃兰州 730000；2.兰州大学药学院本科09级，甘肃兰州 730000）

以甘肃道地药材大黄为对象，研究其活性成分，充分利用兰州大学药学院实验中心先进仪器设备，改变仅以pH梯度萃取法提取分离大黄中蒽醌类化合物的现状，将该基础性实验提升为综合性实验。从而培养大学生的动手能力、实验设计能力及理论与实践的结合能力。同时实现教学与科研结合，达到以教学促进科研，以科研激发教学的目的。

大黄；蒽醌衍生物；高效液相色谱；含量测定

综合性实验是指由多项实验任务组成，经过系列的实施程序，最终得到某种结果的实验，该类实验需要体现多知识点或多学科的整合。兰州大学药学院天然药物化课程中实验二“大黄药材的提取与分离实验”，要求学生掌握梯度pH萃取法和提取分离大黄中各种蒽醌苷元的原理及实验方法，了解蒽醌类化合物的颜色反应及色谱检查方法，这属于专业基础性实验。但该实验存在一些问题：（1）属验证性实验，学生只需按规定的方法步骤完成，各门学科综合知识得不到体现。（2）提取分离前学生仅从课本和教师讲解中了解大黄药材中含蒽醌类成分，没有实验的感性认识；（3）大黄药材用梯度pH法进行提取和粗分离，只能得到大黄酸、大黄素、芦荟大黄素3种化合物，其中大黄酚和大黄素甲醚是混合物，不能分开；（4）没有化合物的纯化和纯度测定步骤，梯度pH法分离得到的大黄酸、大黄素、芦荟大黄素3种化合物不纯，但学生误认为是纯品；（5）几乎没有使用任何精密的大型仪器。这样的实验即不满足天然药物化学化实验教学要求，也不符合高等学校培养精英人才宗旨，又浪费药材资源。所以我的将这种简单验证性实验改革为综合性实验，使学生们将所学的天然药物化学、药物分析学、现代色谱技术、中药制剂分析学、波谱解析等多门课程的知识在实验中综合应用，提高了学生实验技能。

1 大黄中蒽醌类化合物的提取分离实验简介

1.1 实验目的

（1）掌握梯度pH萃取法和提取分离大黄中各种蒽醌苷元的原理及实验方法；

（2）了解蒽醌类化合物的颜色反应及色谱检查方法。

1.2 实验原理和主要内容

本实验是根据大黄中的蒽醌类甙元成分能溶于氯仿的性质，采用氯仿提取，又利用羟基蒽醌类化合物酸性强弱不同，用pH梯度法进行分离。具有羧基或多个β位酚羟基的蒽醌可溶于5%碳酸氢钠溶液；具有一个β位酚羟基的蒽醌可溶于5%碳酸钠溶液，只具有α位酚羟基的蒽醌，酸性弱，只溶于氢氧化钠溶液。

以上是本科生试验的原理和主要内容。本文中将大黄中蒽醌类化合物提取分离实验改革为综合性实验——大黄中活性成分的研究。本项目用双向酸水解法、梯度pH法和柱色谱法联合应用分离大黄中的活性成分，用MS、NMR法解析结构，HPLC（高效液相色谱法）和UV（紫外分光光度法）测定大黄药材中活性成分和单体化合物含量，比较2种方法差异，制备单体化合物对照品［1-4］；通过系统改进，激发学生实践学习的积极性，有利于学生动手能力培养，仪器的认识与操作，综合思维与创新能力培养。

2 大黄中不同活性成分的研究综合实验方案

2.1 大黄药材的HPLC和UV含量测定比较

2.1.1 混合对照品溶液

分别精密称取芦荟大黄素1.67mg、大黄酸1.71 mg、大黄素0.68mg、大黄酚5.03mg、大黄素甲醚1.45mg，置25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为混合对照品溶液［5-6］。

2.1.2 供试品溶液

取样品细粉约0.5g，精密称定，加氯仿30mL，水10mL，浓盐酸2mL，回流水解2h，冷却，移置分液漏斗中，用少量氯仿洗涤容器，洗涤液并入分液漏斗中，分取氯仿层，酸液用氯仿萃取4次，每次20mL，合并氯仿液，并回收氯仿，残渣用甲醇定容至10mL，摇匀，过0.45m的微孔滤膜，作为供试品溶液。

2.1.3 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18（2）柱（5μ，4.6mm×250 mm，迪马公司生产）；流动相：甲醇-1%醋酸，梯度洗脱，流动相组成及流速见表1，进样10μL。检测波长：430nm（大黄蒽醌衍生物）；柱温25℃。该色谱条件下，5种成分的先后出峰顺序分别为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚，保留时间与对照品的保留时间一致，见图1。

表1 流动相组成

图1 大黄HPLC色谱图

2.1.4 色谱波长确定

对供试品溶液在190～800nm范围内进行全波长扫描，结果表明：芦荟大黄素在430.4nm、大黄酸在431.6nm、大黄素在441.3nm、大黄酚在430.4nm、大黄素甲醚在435.2nm有最大吸收，故选择430nm作为检测波长，见图2。

图2 芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的紫外光谱图

2.1.5 样品的HPLC含量测定

照本文中所述色谱条件，三组学生对大黄药材进行含量测定。结果见表2。

表2 样品含量测定结果mg／g

2.1.6 UV含量测定

根据图2可知，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚这5种成分在430nm处均有吸收，故紫外的含量测定只能测到总蒽醌的量，不能测定每个部分的含量。学生1、2、3组分别测得的总蒽醌的量为16.39、22.34、16.53mg·g-1。

2.2 大黄中活性成分的提取分离

2.2.1 大黄中蒽醌甙元的提取

取大黄粗粉50g置于1 000mL圆底烧瓶中，加20%H2SO430mL，氯仿200mL，水浴回流1h，滤出浸液，药渣再加20%H2SO430mL，氯仿200mL，水浴回流45min，滤出浸液，合并所得浸液，回收氯仿至剩余氯仿约100mL，用蒸馏水洗至pH6。

2.2.2 大黄酸的分离

上层氯仿液用5%NaHCO3溶液萃取4次，（80、60、40、40mL），合并NaHCO3液，用盐酸中和至不再析出沉淀，析出棕黄色沉淀（若不出现沉淀，水浴上加热）抽滤，水洗，70℃烘干，用少量冰醋酸重结晶，析出黄色针晶为大黄酸，抽滤烘干，称重。

2.2.3 大黄素的分离

经NaHCO3溶液提取过的氯仿液，继用5% Na2CO3溶液萃取4次（80、60、40、40mL）。合并Na2CO3液，用盐酸中和至不再析出沉淀，析出棕黄色沉淀（若不出现沉淀，水浴上加热）抽滤，水洗，70℃烘干，用少量无水乙醇重结晶，析出橙色针晶为大黄素、抽滤，烘干，称重。

2.2.4 芦荟大黄素，大黄素甲醚和大黄酚混合物的分离

经Na2CO3提取过的氯仿液，再用5%NaOH溶液提取4次（80、60、40、40mL），合并NaOH液，用盐酸中和至不再析出沉淀，析出黄色沉淀，抽滤，水洗，70℃烘干，称重。

2.2.5 芦荟大黄素的分离

4得沉淀物溶于少量氯仿（约30mL），用0.25% NaOH溶液提取3次（20、10、10mL），合并提取液用盐酸中和至中性，析出棕黄色沉淀，抽滤，70℃烘干，用少量乙酸乙酯重结晶，析出棕黄色针晶为芦荟大黄素，抽滤，烘干，称重。

2.2.6 大黄素甲醚和大黄酚混合物的分离

经0.25%NaOH提取过的氯仿液再用5%NaOH提取3次（20、10、10mL），合并提取液，用盐酸中和至中性，析出黄色沉淀，抽滤。水洗，70℃烘干，用少量乙酸乙酯重结晶，得大黄素甲醚和大黄酚混合物，抽滤，烘干，称重。

2.2.7 大黄酚和大黄素甲醚的柱色谱分离

（1）薄层硅胶板的制备。配制质量分数为0.3%的羧甲基纤维素钠（CMC—Na）水溶液，与薄层层析硅胶G粉，按3mL∶1g的比例配制调浆，以载玻片作为载体铺板，铺好后晾干，于105℃下活化1h，放人干燥器中，备用［7-12］。

（2）色谱柱的制备。取一根内径和长度合适的玻璃层析柱，用洗脱剂湿法装柱，用手轻敲柱子，使硅胶装填结实且顶端平整，有效柱长控制在20cm左右，硅胶用量为20g（工业级柱层析硅胶（100～200目）。

（3）样品的制备。大黄酚和大黄素甲醚的混合物约（0.1g）用最少量的三氯甲烷溶解，再加入适量硅胶拌样（约0.5g），待氯仿挥发干后均匀铺于柱顶。

（4）洗脱。以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯-甲酸（体积比100∶1∶0.5）为洗脱剂，进行洗脱，洗脱液减压浓缩后可循环利用。

（5）色谱带的定位。洗脱一定时间后可以看见两段明显的色谱带，洗脱得快的那一段为大黄酚，较慢的那一段为大黄素甲醚。继续洗脱，分别得到橙红色颗粒状结晶（大黄酚）和橙黄色针状结晶（大黄素甲醚）。

（6）薄层色谱鉴定。取制备好的薄层硅胶板，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸（体积比10∶1∶0.5）为展开剂，以对照品作对照，确定橙红色颗粒状结晶为大黄酚，橙黄色针状结晶为大黄素甲醚。

2.3 纯度测定

2.3.1 TLC薄层鉴别

（1）固定相：硅胶G板（青岛海洋化工厂）；

（2）样品：大黄药材；大黄混合对照品；精制大黄酸；精制大黄素；精制大黄酚；精制大黄素甲醚；大黄素甲醚和大黄酚混合物；

（3）展开剂：石油醚（60～90℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）；

（4）显色：可见光下观察色斑，再于紫外灯（365 nm）下观察荧光斑点，结果见图3。

图3 大黄的薄层色谱鉴定

从下至上依次为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚的斑点Rf依次为0.087、0.127、0.187、0.527、0.587。

王定勇等研究发现大黄酸、大黄素和芦荟大黄素可以通过简单的pH梯度萃取法和重结晶得到单体，而大黄酚和大黄素甲醚在植物体内常共同存在，它们结构相似，酸性与极性相近，分离很困难，所以采用pH梯度萃取法得到大黄素甲醚和大黄酚混合物、再用柱色谱分离，得到纯度较高大黄素甲醚、大黄酚的单体。大黄酸用冰醋酸、大黄素用无水乙醇、芦荟大黄素用乙酸乙酯重结晶，大黄酸和大黄素得到单体（纯度≥95%），而芦荟大黄素部分产率太低，经数次重结晶没有拿到纯度≥95%的单体，故没有薄层色谱鉴定。

2.3.2 HPLC的纯度测定（面积归一化法）

使用上述色谱条件，检测结果表明大黄酸纯度为98.93%、大黄素纯度为98.85%、大黄酚纯度为98.66%，大黄素甲醚纯度为99.74%，见图4、图5、图6、图7。

图4 大黄酸的HPLC图

图5 大黄素的HPLC图

图6 大黄酚的HPLC图

图7 大黄素甲醚的HPLC图

2.4 大黄酚和大黄素甲醚的结构鉴别

（1）化合物Ⅰ为橙红色颗粒状结晶，熔点196～197℃。紫外光谱中在224nm、257nm、287nm、430 nm处出现吸收峰，说明是蒽醌类化合物。分子式为C15H10O4，其相对分子量M为254，EI-MS图谱中m／z255为M＋1峰，证明化合物属羟基蒽醌。化合物Ⅰ1H-NMR（CDCl3）数据如下：δ：2.46（s，3H，CH3），7.10（d，1H，C2-H），7.28（dd，1H，C7-H），7.82（dd，1H，C5-H），7.65（m，2H，C4-H、C6-H），11.99（s，1H，C1-OH），12.11（s，1H，C8-OH）；13C-NMR（CDCl3）δ：192.5（C9），181.98（C10），162.7（C1），162.4（C8），149.3（C3），136.9（C6），133.7（C11），124.5（C5），124.4（C2），121.3（C4），119.9（C7），113.7（C13），22.3（8Me）。以上数据与文献［13］报道的大黄酚数据一致，通过紫外、质谱和核磁数据的分析，确定化合物Ⅰ为大黄酚，结构式如图8（a）所示。

（2）化合物Ⅱ为橙黄色针状结晶，熔点202～204℃。紫外光谱中在224，265，286，435nm处出现吸收峰，说明是蒽醌类化合物。分子式为C16H12O5，其相对分子量M为284，EI-MS图谱中m／z284为分子离子峰，证明化合物属羟基蒽醌。化合物I的1HNMR（CDCl3）数据如下：δ：2.44（s，3H，CH3），3.48（s，3H，OCH3），6.67（s，1H，C2-H），7.07（d，1H，C7-H），7.26（S，1H，C4-H），7.35（m，1H，C5-H），12.09（S，1H，C1-OH），12.30（s，1H，C8-OH）；13C-NMR（CDCl3）δ：21.3（6位CH3），55.62（CH3O），190.8（9位C＝O），181.99（10位C＝O），113.7、110.26、121.27、124.49（4个蒽醌母核的CH），以上数据与文献［14］报道的大黄酚数据一致，通过紫外、质谱和核磁数据的分析，确定化合物Ⅱ为大黄素甲醚，结构式如图8（b）所示。

图8 化合Ⅰ和Ⅱ的化学结构式

3 实验效果与讨论

（1）增加高效液相色谱（HPLC）法和紫外（UV）法两种方法测定大黄药材中蒽醌类和单体化合物的含量，使学生熟悉药物分析和中药制剂分析中最常用的现代高效液相色谱仪的性能和使用方法，掌握HPLC法和UV法测定中药中指标成分的方法和原理的不同，HPLC法可以测到每一种成分的含量，但是UV法只能测到总蒽醌的量，同时还可能测定到其他杂质，故UV法测得的含量比HPLC测得的含量高。

（2）用多种提取分离方法提取分离纯化蒽醌类化合物，通过双向酸水解、PH梯度萃取和柱色谱法联合使用，使学生熟悉天然药物化学中最常用的几种分离纯化化合物的操作方法，柱色谱上两条明显的色带，直观的展示了色谱原理。

（3）通过质谱、核磁共振等技术分析单体化合物结构。结构解析是历届药学院学生在学习天然药物化学课程和波谱解析课程中比较难的内容，通过该实验使学生熟悉结构解析过程和方法。

（4）增加纯度测定方法，使学生掌握天然药物化学课程的最基本的实验技能。

4 结语

综合性实验可以是新的实验方法、技术或者对已有实验的改造和改良［15-16］。本综合性实验涉及天然药物化学、药物化学、现代色谱、中药制剂分析、药物分析等多学科内容，提高了学生的创新能力，给学生提供最大的自由空间，使他们能够充分发挥自身的实践能力：充分利用现代技术手段，使学生了解和应用当前新技术，牢固掌握所学的理论知识；培养学生的动手能力，激发学生利用新技术的兴趣和将所学知识应用于实际教学问题的能力，充分调动了学生学习的主动性、积极性和创造性，提高了学生的分析问题、解决问题能力，促进了学生的创新思维和实践能力。各种大型仪器和小型仪器综合使用，各门知识的综合应用，通过一系列系统实验将一个基础性实验打造成应用型综合性实验。

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Comprehensive experiment of different active compounds in Chinese rhubarb

Liu Xiaohua1，Hu Fangdi1，Li Wen1，Feng Shilan1，Nan Xuwen2，Wang Haiqing2
（School of Pharmacy，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China）

This article investigates the active compounds comprehensively with Chinese rhubarb which is the medicinal rubherb in Gansu Province，and considers to make full use of the resources of experimental center in School of Pharmacy of Lanzhou University，which can change the fact that is only based on the pH gradient extraction to separate the anthraquinones in rhubarb.Thus the basic experiment can be promoted to the comprehensive experiment，which can cultivate the abilities of practice，design experiments and the combination of theory and practice，stimulate the practical enthusiasm of the students，combine the teaching with scientific research，and get the aim that teaching can promote the scientific research and the scientific research can stimulate teaching.

Chinese rhubarb；anthraquinone derivatives；HPLC；content determination

R 965

A

1002-4956（2013）03-0047-05

2012-06-19

刘小花（1976—），女，甘肃兰州，实验师，在职博士研究生，兰州大学药学院实验中心副主任，研究方向：药物分析学

E-mail：liuxiaoh＠lzu.edu.cn

封士兰（1957—），女，陕西安康，教授，博士生导师，从事中药中化学成份分离分析及中药新药研究工作.

E-mail：fengshl＠Lzu.edu.cn