小麦基因组原位杂交技术的影响因素分析

王小利，王军卫

（西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 71210）

小麦基因组原位杂交技术的影响因素分析

王小利，王军卫

（西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 71210）

采用切口平移法标记外源物种（黑麦）总基因组DNA作为探针，用受体物种总基因组DNA（中国春小麦）作遮盖，对小麦1B／1R易位系中外源染色体的黑麦易位片段进行检测。对影响基因组原位杂交技术实验效果的因素进行了分析。通过实验认为：细胞分裂相多、染色体分散良好、染色体长度适中的高质量染色体制片是取得理想实验效果的基础；保证在整个实验过程中染色体一直附着在载玻片上不丢失是实验进行的支撑条件；探针DNA与封阻DNA的比例是取得理想实验效果的关键。对杂交信号过多或过少或者无杂交信号的技术环节进行了分析，并提出了解决办法。实验过程中应严格控制每一步骤，才能获得理想的原位杂交实验效果。

小麦基因组原位杂交；影响因素；切口平移法

1 基因组原位杂交简介

基因组原位杂交（genomic in situ hybridization，GISH）是20世纪80年代末发展起来的一种原位杂交技术。GISH是以来源不同的物种之一的总基因组DNA通过生物素、DIG、荧光素等标记物标记后做探针，在靶染色体上进行原位杂交杂种染色体制片上，而其他亲本的基因组总DNA（或非探针的其他DNA）以一定的浓度比例来封闭杂种染色体上探针的非特异结合位点，尽可能使杂种染色体上的特异位点暴露出来供探针杂交。在封阻DNA和探针DNA之间，封阻NDA优先与一般序列杂交，剩下的特异序列主要被标记探针杂交，然后通过与该标记物耦合的荧光素免疫反应，检测该亲本染色体或染色体片段在杂种中的存在状况［1-6］。

植物染色体基因组原位杂交技术是农林院校作物遗传育种专业分子细胞遗传学的重要实验技术。该技术的兴起与发展为遗传学研究中检测外源染色质，进行某一特定DNA序列或基因的染色体物理定位，研究异源多倍体物种中各染色体组间的部分同源关系，研究物种起源进化及物种间的亲缘关系，以及分析导入不同核背景中的染色质的定位、行为、表达及结构等方面发挥了重要作用。

小麦的近缘属种中蕴藏着丰富的有益基因是小麦遗传改良的重要基因源之一。通过栽培小麦与近缘物种属间远缘杂交，结合染色体工程进行定向选择，可将外源优良基因转移到小麦中。而外源基因的有效转移与利用，在很大程度上依赖于对导入小麦背景中的外源染色体或染色体片段的准确鉴定。目前，利用外源物种总基因组DNA作探针的GISH技术，已完全应用到小麦背景中大赖草、中间偃麦草、簇毛麦、东方旱麦草、新麦草、黑麦、长穗偃麦草、冰草等近缘植物的染色体或染色体片段的鉴定。同时，也利用物种专化DNA序列作探针的荧光原位杂交技术，鉴定了大量小麦近缘植物的染色体或染色体片段［7-10］。本文采用切口平移法标记外源物种总基因组DNA（黑麦）作为探针，用受体物种总基因组DNA（中国春小麦）作遮盖，对小麦品系（小麦黑麦易位系）中外源染色体的易位片段进行检测，系统介绍了本实验技术的关键环节，对制备染色体、标记探针、探针与靶染色体的杂交以及对检测杂交结果的过程中的影响因素进行了全面分析。

2 材料与方法

2.1 材料

封阻材料为中国春小麦，探针材料为小麦近缘植物黑麦，测试材料为小麦-黑麦易位系5-1。

2.2 方法

2.2.1 根尖染色体制片

将小麦-黑麦易位系种子消毒后用水浸泡24h，然后置于铺有吸水纸的培养皿中（温度为25℃）；当根长至1～2cm时取根尖于冰水中预处理22～24h，然后用卡诺固定液（95%乙醇与冰乙酸的比例为3∶1）固定2～3d；45%冰乙酸软化5～10min，45%冰乙酸压片；或用1%醋酸洋红染色（无Fe），45%冰乙酸压片；或者充分水洗后用1.5%纤维素酶和果胶酶处理2～3 h，45%冰乙酸压片；用液氮或超低温冰箱冷冻揭片后，放入45℃的45%冰乙酸3min，然后气干；用相差显微镜观察，选择分裂相好的制片用于染色体原位杂交，-20℃干燥保存。

2.2.2 探针标记及封阻DNA的处理

将封阻材料（中国春小麦）和探针材料（黑麦）的种子消毒后用水浸泡12h，置于铺有吸水纸的培养皿中（25℃），于黑暗条件下生长出黄化苗；用CTAB法提取易位系和中国春小麦DNA；基因组DNA经纯化后用DIG-Nick Translation Mix（Roche，Germany）标记；把1μg模板DNA溶于16μL双蒸水中，加入4μL DIG-Nick-Translation Mix混匀，离心，在15℃下反应90min后停止反应；加入1μL EDTA（0.5mol／L，pH 8.0）在65℃下放置10min，探针DNA的浓度为50mg／L，4℃保存备用。封阻DNA前用超声波处理5min，或在沸水中煮40～50min。

2.2.3 探针DNA与封阻NDA杂交

将染色体制片在60℃干燥1h后，用RNaseA 37℃处理1h，2×SSC室温清洗5min后晾干；用70%去离子甲酰胺70℃变性2～3min；然后分别在-20℃下预冷的70%、85%、95%、100%乙醇中各脱水5min，然后风干。封阻DNA与探针DNA的比例一般为50∶1，每个制片杂交液含100%甲酰胺20μL、20×SSC 4μL、50%DS 6μL、ssDNA（10mg／mL）1 μL，10%SDS 1μL、探针DNA（50mg／L）3μL和封阻DNA（500mg／L）5μL。以上杂交液混匀后在100℃水浴中变性10min，立即置于冰中2min；变性处理后的每张制片加40μL变性的杂交液，在60℃的用2×SSC润湿的盒中温育10min，然后放37℃杂交过夜；杂交完毕后脱去盖玻片，依次在2×SSC室温7min，30%去离子甲酰胺37℃10min，2×SSC 37℃7min，2×SSC室温7min，1×PBS室温7min中洗脱未杂交上的探针［11-13］。

2.2.4 荧光信号的检测

经1×PBS洗过的制片上滴0.5～1mL的1× Blocking，15～25℃放置30min，吸去多余水分；吸50μL的anti-DIG溶液于载玻片上，盖片，37℃放置60min（保湿）；在37℃下用漂洗缓冲液轻洗3次；吸50μL的anti-mouse-lg-DIG溶液于载玻片上，盖片，37℃放置60min（保湿）；在37℃用漂洗缓冲液轻洗3次；吸50μL的anti-DIG-flourescein溶液于载玻片上，盖片，37℃放置60min（黑暗，保湿）；在37℃用漂洗缓冲液轻洗3次，每次5min；用含适量PI的抗褪色剂封片（0.1μL PI＋25μL抗褪色剂）；最后用OLYMPUS BX51荧光显微镜观察原位杂交结果。在荧光滤色镜U-MWIB2（激发波长460～490nm）下，FITC检测的探针信号为黄绿色，经PI染色的其他染色体为红色，因而，该检测材料为小麦黑麦端部易位系。

3 结果与分析

3.1 染色体制片质量对原位杂交效果的影响

3.1.1 染色体分散状况

染色体分散清晰、染色体互不重叠以及染色体长度形态良好的制片是小麦GISH技术效果好坏的基础［14-16］。在实验过程中要根据具体情况调整供试材料预处理和压片过程，提高染色体分散状况，以得到高质量的染色体制片。就小麦而言，在25℃条件下培养小麦种子容易获得根尖分生区有丝分裂中期的细胞，温度过高或过低都会影响根尖细胞的分裂；当根点长到1cm左右时，使根点处于4℃左右的水中进行预处理24h左右，时间太短，具有中期分裂相的细胞不多，时间太长染色体浓缩太短，影响杂交的分辨率。同时注意预处理水最好是自来水，可提供根尖一定的氧气，有利于积聚更多的中期分裂相的细胞，可大大提高压片的成功率。固定根尖的时间不要太长，以2～24h为宜，固定时间过短，根尖细胞很脆，细胞不容易分散，固定时间过长，染色体就容易模糊。可将固定好的根尖转入70%乙醇中4℃保存，但保存时间不宜过长，一般不要超过1周。在压片以前，注意一定要把根点细胞敲成雾状，力度要适中，力度太小，细胞分散不开，力度太大，同一细胞的染色体不在一起或者染色体容易被敲碎，无法对染色体计数；压片时，力度不可以太大，这样染色体往往不容易分散（见图1），可以用小力度多次压片的方法使染色体不断分散，每次从盖玻片边缘渗入45%乙酸，在酒精灯上微微加热后轻轻压片，往往可以获得分散度良好的染色体制片。

图1 分散不好的染色体制片

3.1.2 染色体浓缩度

影响GISH的因素之一是染色质的凝缩程度，浓缩度越高，分辨率和灵敏度就越低。就植物染色体制片而言，凝缩程度不同的靶DNA载体有有丝分裂中期染色体、减数分裂粗线期染色体、间期细胞核。有丝分裂中期染色体制片相对容易，仍可保持染色体的结构，如着丝粒、端粒和次绕痕，利于靶序列的定向和定位，它的染色体凝缩程度最高，分辨率和灵敏度最低。在染色体制片时，尽量选择有丝分裂中期偏前的细胞，这样的染色体比较细长一些，可适当提高GISH的分辨率。图2显示的小麦染色体虽然比较分散，也容易数清楚，但是作为原位杂交的染色体制片由于其染色体浓缩太短就不太适合。减数分裂粗线期染色体由于染色质凝缩程度降低，探针易于进入，所以检测灵敏度也得到了一定程度的提高，显示外源染色体的配对情况，明确外源染色体间同源关系，但染色体上不同区域分辨率有很大差别，异染色质区的分辨率依然不高。间期细胞核的染色质凝缩程度要明显低于中期和粗线期染色体，间期细胞核染色质制片较容易，随着染色质凝缩程度的降低，分辨率和灵敏度都有了很大程度提高，但也存在缺点，即不能确定信号相对于着丝粒、端粒和异染色质块的位置和方向。为了弥补上述缺点，可将中期的杂交结果同间期相结合，或使用已知位置的DNA标记同未知DNA序列共定位，从而有利于目的基因的检测。所以尽管GISH具有快速、直观、操作简便、不需分离特异性探针等优点，但它也有一定的局限性，单纯用GISH无法确定外源染色体或染色体片段属于哪个同源群、代换系所取代的特定染色体、易位系所发生的位置和断点。

图2 染色体浓缩太短

3.2 实验过程中染色体易丢失

有时在检测的过程中会出现染色体数目减少或者制片上细胞和染色体完全丢失（见图3）。造成这种现象的原因有：因载玻片不干净造成染色体固定不牢、压片时根尖细胞未分散开使气泡进入染色体制片、冷冻揭片时动作太慢或揭片时冷冻不足以至染色体随盖片被揭掉而造成染色体丢失。因此制片前载玻片要用铬酸洗液浸泡，用自来水冲洗后，再用蒸馏水冲洗晾干，保证载玻片清洁；压片时一定要使根尖细胞均匀分散在盖玻片与载玻片之间，染色体制片做好之后应及时在液氮中冷冻，防止冰乙酸挥发气泡进入盖玻片与载玻片缝隙；在液氮中冷冻时间稍长一些，一般为3～5 min，揭片时动作尽可能迅速，揭片以后让制片充分干燥，有利于染色体在载玻片上的附着。另外染色体制片在杂交和冲洗过程中，力度太大也可以造成染色体丢失。

图3 染色体丢失

3.3 封阻DNA对杂交效果的影响

所检测外源染色体基因组与背景材料基因组之间同源性越远，由交叉杂交现象（探针DNA与小麦染色体DNA之间发生杂交）所造成的干扰越小，外源染色体越容易检测；所检测外源染色体基因组与背景材料基因组之间同源性越近，则由交叉杂交现象所造成的干扰越大，外源染色体越难检测。也就是说外源染色体基因组与背景材料基因组之间同源性远近在一定程度上影响着GISH实验的效果。封阻是指非检测染色体DNA，其作用是除去探针、染色体中的相同序列，使其不能和非检测染色体杂交。由于同源序列首先杂交，因而可阻止探针DNA与非特异性位点杂交或非目标DNA杂交，封阻DNA也可通过空间隔离防止探针DNA与相似DNA杂交。所以当基因组探针与未标记的封阻DNA结合使用时，可很好地区分目标DNA和非目标DNA。加入封阻DNA对于亲缘关系较近物种的鉴别是必须的，GISH中无论是探针还是封阻都必须通过染色体的立体结构来完成杂交，所以其长度必须有利于在染色体的立体结构中穿梭，将被检测材料的对照（中国春小麦）的总DNA剪切成大约250bp片段后，不加任何标记且过量加入杂交混合液，能够提高探针DNA杂交的特异性。目前常用的DNA剪切法有超声波剪切法、煮沸法、高压剪切法、微量注射器反复抽提法等。通过琼脂糖电泳检测片断大小，研究表明DNA长度在200～500bp最有利于杂交，有效地封阻非特异性位点。

3.4 杂交信号过多或过少或者无杂交信号

3.4.1 杂交信号过多

造成杂交信号过多的原因之一是封阻DNA不足，导致探针在非目标DNA上产生较多的非特异性杂交，因而显示许多弱的非特异性杂交信号（见图4）。探针与封阻DNA的比例根据不同供试材料之间基因组同源关系远近而差异较大，因此在杂交时需要的封阻DNA的量也不相同，小麦与黑麦染色体有75%相同的序列，而在检测小麦中的黑麦染色体时，需要用约50倍于探针浓度的未标记小麦gDNA作封阻。造成杂交信号过多的另外一个原因是杂交后洗脱强度不足。洗脱的目的主要是去掉非特异性杂交信号，洗脱强度不足时，会增加非特异性杂交信号，因此实验过程中要根据不同情况仔细摸索洗脱条件，如洗脱液离子浓度、洗脱温度及洗脱时间，并严格控制洗脱条件。此外，所检测的外源染色体所在的基因组与背景材料染色体所在的基因组同源关系较近也容易造成杂交信号过多，这是由于交叉杂交现象造成的。实验过程中为避免交叉杂交现象的影响应严格控制洗脱条件及洗脱强度。必须注意的是漂洗的过程中，切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强了背景染色。实验过程中配制试剂时要使用质量高的去离子水，在洗脱环节时操作要快，尽量减少杂质污染。

图4 杂交信号太多

3.4.2 杂交信号过少

造成杂交信号过少（见图5）的原因之一是杂交不充分。在杂交过程中杂交时间稍长一些实验效果相对好一些，杂交温度应严格控制在36～38℃范围内。造成杂交信号过少的另外一个原因是封阻DNA过量。过量的封阻DNA与目标DNA杂交，只有少量与封阻DNA完全不同源的目标DNA与探针杂交，产生较少的杂交信号。出现这种情况可以通过适当减少封阻DNA来改进实验效果。造成杂交信号过少还有一个原因是杂交后洗脱强度过大，洗脱的目的主要是去掉非特异性杂交信号，洗脱强度过大时，部分特异性杂交信号也被洗脱掉，因此实验过程中要根据不同情况仔细摸索洗脱条件并严格控制洗脱条件。另外，PI的浓度过大或者染色时间太长，或者染色后洗脱强度不够，多余的PI遮盖了杂交信号，也会造成杂交信号的减少。

图5 杂交信号太少

3.4.3 无杂交信号

GISH实验最不理想的结果就是无杂交信号（见图6）。造成这种现象的原因：一是DNA未变性；二是探针未标记上。在麦类作物原位杂交实验过程中采用高温变性一般不存在未变性问题，但温度过高、时间过长会影响染色体的形态；探针未标记上的原因主要是gDNA质量和标记温度造成的。在用切口平移法对黑麦总DNA进行标记之前，必须对总DNA进行剪切，以适合DnaseⅠ／DNA聚合酶Ⅰ作用大小（大约10～12kb）。要产生这种长度的DNA片段，可以用剧烈的旋涡振荡，反复冻融，超声处理或用直径细小的针抽挤DNA。也可用切口平移时加长DnaseⅠ酶解消化时间或增加DnaseⅠ的浓度。另外还有的是实验材料无目标染色体，这可能是一些远缘杂交后代分离时部分植株外源染色体丢失。

图6 无杂交信号

4 结论

本实验以小麦1B／1R易位系为实验材料，对影响GISH技术实验效果的因素进行了分析。通过实验认为：细胞分裂相多、染色体分散良好、染色体长度适中及无杂质影响的高质量的染色体制片是取得理想实验效果的基础；检测的外源染色体所在的基因组与背景材料基因组同源关系的远近以及探针DNA浓度与封阻DNA浓度的比例是取得理想实验效果的关键；保证在整个实验过程中染色体一直附着在载玻片上不丢失是实验进行的支撑条件。麦类作物GISH实验技术中操作步骤较多、操作过程比较繁琐、影响因素较多，因此在实验过程中应严格控制每一步骤，才能获得理想的原位杂交实验效果。

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Analysis on influencing factors wheat genome in situ hybridization

Wang Xiaoli，Wang Junwei
（Agronomy College，Northwest Agriculture and forestry University，Yangling 712100，China）

The genome in situ hybridization（GISH）is an ideal technology of the direct detection of target DNA in the nucleus in the presence and distribution，which particularly facilitates in the identification exogenous chromosomes or chromosome segments of additional lines，substitution line，translocation lines genetic material and genome composition of allopolyploid species.By nick translation labeled exogenous species（rye）total genomic DNA as a probe，with receptor species total genomic DNA（China Spring Wheat）as a cover，exogenous chromosomes of rye translocation fragments was detected in 1B／1Rwheat translocation lines，the key experimental technology links of GISH technology were introduced，and influencing factors were analyzed.Experiments show that（1）the high quality chromosome preparation is the foundation of obtaining the ideal experimental effect with phase cell，chromosome，chromosome length of well dispersed with moderate；（2）that chromosome has been attached to the slide，which may not lose the supporting conditions during the whole experiment process；（3）the ratio of probe DNA to blocking DNA is key of obtaining the ideal effect；（4）technical links to hybridization signals too little or too much or no hybridization signal were analyzed.Every step should be strictly controlled in order to obtain the desired effect in situ hybridization experimental process.

wheat；genome in situ hybridization（GISH）；influencingfactor

S512.1

A

1002-4956（2013）03-0039-05

2012-06-25

国家自然科学基金项目（30971844）

王小利（1967—），女，陕西华县，博士，高级实验师，农业生物技术实验室主任，主要从事小麦分子细胞遗传学研究和农业生物技术实验室管理工作.

E-mail：nwwangxl＠126.com