条斑紫菜高纯度藻红蛋白规模制备及光学性质研究

郭子叶 蔡春尔，2 李春霞 耿中雷 贾睿，2 何培民，2

（1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2.上海海洋大学海洋科学研究院，上海 201306）

藻胆蛋白（phycobiliproteins，PBP）包括藻红蛋白（phycoerythrin，PE）、藻蓝蛋白（phycocyanin，PC）和变藻蓝蛋白（allo-phycocyanin，APC）等，是部分藻类的天然色素，水溶性好，颜色鲜艳，且具荧光特性［1］。70多年来的研究表明，藻胆蛋白用途极为广泛，可作为天然色素添加于食品、化妆品、保健品、药品、纺织品、洗涤剂，甚至喷泉中［2，3］，最广泛的用途是制成荧光标记探针［4］，目前主要在Cyanotech Corporation、Martek Bioscience、PROzyme Inc.等大公司出售，价格高昂［5］。

半个多世纪来，人们试验了各种藻胆蛋白制备方法，如Padgett等［6］采用Diethylaminoethyl（DEAE）Cellulose琼脂糖凝胶层析纯化550 gMicrocystis aeruginosa得到33 g纯度3.4的PC和2.3 g纯度4.0的APC，王广策等［8］采用疏水层析纯化700 gGracilaria verrucosa得到98 mg纯度4.4的PE［7］，纯化550 gPalmaria palmata得到67 mg纯度3.5的PE，Niu等［9］纯化15 gPorphyra haitanensis叶状体得到23 mg纯度4.8的PE。此外，还有一些蛋白小量快速制备用于检测的简单方法［10-12］。藻胆蛋白常规提纯方法的使用效果因原料不同而各有差异［13］，如以中国最主要的栽培藻类之一条斑紫菜为对象规模纯化藻红蛋白时，上述方法似乎不大理想［14］。

藻胆蛋白作为荧光蛋白，摩尔消光系数表征其吸光能力，荧光量子产率表征其荧光发射能力，光漂白时间表征其光耐受能力，这些都是蛋白荧光标记和光动力学应用中的重要参数。目前已报道摩尔消光系数的藻胆蛋白有坛紫菜藻胆蛋白［15］，多管藻藻红蛋白，钝顶螺旋藻藻蓝蛋白，倒卵圆形隐丝藻藻红蛋白，集孢藻藻蓝蛋白［16］，已报道荧光量子产率的有螺旋藻藻胆蛋白［17］，已报道光漂白效果的有多管藻藻红蛋白［18］。

目前虽然海洋经济在中国国民经济中的地位不断上升，但海边的渔民生活却存在不少问题，鱼塘养殖面积逐步减少，水产加工及流通发展滞后，养殖成本不断提高，渔业资源日趋衰竭，传统捕捞渔民无地可耕，渔民由于年龄、素质等原因转产转业十分困难，使得渔民生活水平难以提高。本试验探索从条斑紫菜中规模制备高纯度藻红蛋白，旨在今后大规模制备藻红蛋白需要大量的紫菜原材料时，为海边的紫菜养殖户开辟新的销售渠道。而条斑紫菜养殖不但成本低、转型快、操作简单，而且生产的藻红蛋白附加值高，有利于提高农民收入。另外，条斑紫菜养殖不仅可为渔民带来效益，也为海区环境治理提供了良方。我们于2002-2004年在中国江苏吕泗海区做了养殖条斑紫菜治理海区富营养化的试验［19］，发现紫菜养殖可使海水中NH4-N、NO2-N、NO3-N和PO4-P的 含 量 降 低50%-94%、42%-91%、21%-38%和 42%-67%。 在 2003-2004年，300 hm2条斑紫菜养殖海区年均从海水中去除14 708.5 kg氮元素和2 373.5 kg磷元素，且栽培期间规模化文蛤养殖未发生死亡现象。表明条斑紫菜栽培去富营养化作用和生态修复功能十分明显。

本试验以2 kg条斑紫菜为原料，尝试规模制备高纯度藻红蛋白的方法，并研究所得蛋白摩尔消光系数，荧光量子产率及在多种光源下的光漂白时间。

1 材料与方法

1.1 材料

条斑紫菜叶状体采自江苏省吕泗紫菜栽培海区。藻体用清洁海水洗净，阴干后密封置于-20℃冰箱保存备用。

4 L捣碎机购自美国Warning公司，Supra 22k高速冷冻离心机购自Hanil Science公司，Ultrospec2000紫外-可见分光光度计购自Pharmacia Biotech公司，EPS601电泳仪购自Amersham Biosciences公司，F-4500荧光分光光度计购自Hitachi公司，伯乐680酶标仪购自美国Biorad公司。化学试剂购自国药集团，均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 条斑紫菜捣碎与蛋白释放 称取2 kg条斑紫菜，加50 mmol/L磷酸钠缓冲液（pH6.8，1 mmol/L EDTA）10 L，完全浸没，4℃存放约36 h。用捣碎机打碎。捣碎液在4℃下10 000×g离心20 min，取上清。

1.2.2 条斑紫菜藻红蛋白粗提 上清液在磁力搅拌器搅拌下，加硫酸铵至20%饱和度，静止8 h，10 000×g离心20 min，取上清液。将上清液续加硫酸铵至50%终饱和度，静止8 h，10 000×g离心20 min，取沉淀，沉淀用适量 50 mmol/L磷酸钠缓冲液溶解。将两次盐析得到的粗提液忽略自身所带盐分，加硫酸铵至10%饱和度，静止8 h，10 000×g离心20 min，取上清液。将上清液续加硫酸铵至40%终饱和度，静止8 h，10 000×g离心20 min，取沉淀，沉淀用适量 50 mmol/L缓冲液溶解，此即为藻红蛋白粗提液，以上步骤均在4℃下操作。

1.2.3 藻红蛋白层析纯化 按Siegelman方法制备HA并预平衡［20］。藻红蛋白粗提液用Sephadex G-25柱脱盐，脱盐液用羟基磷灰石柱层析，用磷酸盐缓冲液（pH6.8）梯度洗脱，洗脱液测吸光值。将层析所得藻红蛋白脱盐后再层析一次。

1.2.4 藻红蛋白纯度鉴定 层析所得藻红蛋白做光谱和电泳鉴定。藻红蛋白吸收光谱纯度用A565/A280表示［1］。蛋白紫外吸收光谱每隔1 nm扫描一次，扫描波长范围250-700 nm，荧光光谱扫描3D图像，每隔5 nm扫描一次，激发波长范围400-600 nm，发射波长范围500-900 nm。电泳均做考马斯亮蓝和醋酸锌双染，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的分离胶和浓缩胶浓度分别为14%和5%，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）的分离胶和浓缩胶浓度均为5%。

1.2.5 藻红蛋白含量和产率计算 藻红蛋白含量计算公式［15］：CPE＝ 0.123A565﹣ 0.068A615﹢ 0.015A650

1.2.6 摩尔消光系数测定 配制浓度为0、25、50、100、200、300和400 μg/mL的牛血清白蛋白，用Folin-酚法以A750吸收值为纵坐标做标准曲线，并取纯度>5.0的藻红蛋白溶液（10 mmol/L磷酸钠，pH6.8）测定浓度，该溶液用紫外—可见分光光度计测定565 nm的吸收值，用Lambert-Beer定律A=CεL反推出565 nm波长的摩尔消光系数。标准蛋白和样品均做6个平行。

配制浓度为0、25、50、100、200、300、400和500 μg/mL的牛血清白蛋白，用Bradford法以A595吸收值为纵坐标做标准曲线，并取和上述同一纯度的藻红蛋白溶液测定浓度，该溶液测定565 nm的吸收值并反推出相应摩尔消光系数。标准蛋白和样品均做6个平行。

1.2.7 荧光量子产率测定 以溶于无水乙醇的5.0 μg/mL罗丹明B为标准溶液，采用参比法测定藻红蛋白荧光量子产率。移取罗丹明B溶液与纯度>5.0的藻红蛋白溶液（A505nm<0.05），在紫外-可见分光光度计上测定其在505 nm处的吸光度。将上述溶液置于荧光比色皿中，在分子荧光光谱仪上分别扫描它们以505 nm为激发波长时的荧光发射光谱，读取相应积分荧光强度。试验做3个平行样。用下述公式计算藻红蛋白在505 nm的荧光量子产率：

Yp=Yr·Fp/Fr·Ar/ApYp、Yr—藻红蛋白和罗丹明B的荧光量子产率；Fp、Fr—为藻红蛋白和罗丹明B的积分荧光强度；

Ap、Ar—为藻红蛋白和罗丹明B在505 nm的吸光值

1.2.8 光漂白时间测定 96孔板中加入纯度>5.0藻红蛋白，蛋白梯度设为15、30、60、120和240 μg/mL，每孔100 μL。分别用日光灯、发光二极管、碘钨灯和激光进行照射，照射时间为10、30、60、120和240 min。另设藻红蛋白60、120和240 μg/mL，每孔100 μL，用激光进行照射，照射时间为10、20和30 min。照射结束后用酶标仪检测溶液在490 nm吸收值，每孔均设3个平行。

2 结果

2.1 蛋白释放效果

经过细胞破碎，获得了8 000 mL溶液，其中含17 262 mg纯度为0.54（A564/A280）藻红蛋白。经过4次硫酸铵盐析，溶液中藻红蛋白纯度不断提高，40%盐析后蛋白纯度达到1.67（A564/A280），含量为13 888 mg（表 1）。

表1 硫酸铵盐析条斑紫菜藻红蛋白粗提液的效果

2.2 蛋白层析效果

粗提液在纯化时只过一次羟基磷灰石柱即可获得纯度＞4.0的藻红蛋白2 234 mg，再过一次该柱可获得纯度＞4.5的藻红蛋白2 172 mg（表2）。

2.3 蛋白纯度鉴定

已纯化的藻红蛋白通过吸收/荧光激发光谱验证（图1）显示，纯化的藻红蛋白最大吸收峰为565 nm，498 nm处有一次峰，540 nm处有一吸收肩，最大荧光发射峰在575 nm。已纯化的蛋白通过SDSPAGE和Native-PAGE的考马斯亮蓝/醋酸锌双染验证。蛋白α、β亚基分子量在14.4-20.1 kD之间，γ亚基在31 kD左右（图2）。

表2 条斑紫菜藻红蛋白通过羟基磷灰石层析的效果

图1 条斑紫菜藻红蛋白的吸收光谱图（A）和荧光发射光谱图（B）

图2 条斑紫菜藻红蛋白SDS-PAGE（A）和Native-PAGE（B）电泳鉴定图谱

2.4 摩尔消光系数测定

条斑紫菜藻红蛋白（10 mmol/L磷酸钠，pH6.8）在565 nm的摩尔消光系数用Folin-酚法测定值为1.79 mL/（mg·cm），用Bradford法测定值为1.73 mL/（mg·cm）（图3），两者非常接近。

2.5 荧光量子产率测定

以罗丹明B溶液在20℃时的量子产率0.97为参照，条斑紫菜藻红蛋白20℃时在505 nm处的荧光量子产率为0.90。

2.6 光漂白时间测定

随着光照时间的增加，PE在日光灯、发光二极管、碘钨灯和激光4种光源下的光漂白效果以激光最显著，240 μg/mL PE 10 min光漂白率可接近碘钨灯辐照240 min的值，而PE浓度越高，同样时间被漂白的蛋白绝对量越大，但即使经过240 min的辐照，各种光源下蛋白在490 nm吸收值依然与自身浓度成正比（图4）。

图3 Folin-酚法（A）和Bradford法（B）测藻红蛋白摩尔消光系数标准曲线图

图4 条斑紫菜藻红蛋白在日光灯（A）、发光二极管（B）、碘钨灯（C）和激光下（D）的光漂白效果图

3 讨论

3.1 关于条斑紫菜藻红蛋白规模纯化

前人对于藻红蛋白规模纯化有不少研究［6-9］，以条斑紫菜为材料的最新方法是膨化柱法。Niu等［14］将28 g条斑紫菜破碎后，上清用phenyl-sepharose疏水层析，得到0.096%纯度2.00-2.50的PE，再用DEAE-sepharose柱最终获得0.082%纯度4.50的PE。而本试验2 kg条斑紫菜在纯化时只过一次羟基磷灰石柱即可获得0.184%纯度＞3.20的藻红蛋白，再过一次该柱可获得0.109%纯度＞4.50的藻红蛋白，省时省力。

对于本提取流程的机理，我们认为可从以下方面解释：首先，盐析与疏水层析的原理相似，都是蛋白质分子在高盐环境下构象改变，疏水基团发生非共价聚合而与其他亲水分子分离，多次盐析效果类似于多次疏水层析；其次，脱盐去除了过小的分子，效果类似于凝胶过滤层析；再次，羟基磷灰石具有独特的立体化学结构，目前已知其与蛋白质的结合有4种作用机理：静电作用，共价复合物的生成，排斥作用，以及电荷的几何分布［21］。这4点的共同作用使得羟基磷灰石与其他介质相比有了明显的选择性。最终使得条斑紫菜高纯度藻红蛋白的规模制备过程较为简捷。

3.2 关于本提纯方法的经济效益

由于使用了廉价的经济海藻作为原料（条斑紫菜市价20元/kg），简单和低成本的粗提工艺（硫酸铵市价16元/kg），自制的羟基磷灰石层析填料，加之较高的蛋白产率和纯度，使得本方法具有较高的经济效益及规模可持续扩大的潜力。

4 结论

采用“溶胀+组织捣碎”法破碎2 kg冻干条斑紫菜叶状体细胞，经多次硫酸铵盐析和一次羟基磷灰石层析后获得纯度>3.20的藻红蛋白的产率为0.184%，再经一次同样层析可获得纯度>4.50的藻红蛋白的产率为0.109%；条斑紫菜藻红蛋白摩尔消光系数经Folin-酚法和Bradford法测定分别为1.79 mL/（mg·cm）和 1.73 mL/（mg·cm）；20℃时，条斑紫菜藻红蛋白在505 nm处的荧光量子产率为0.90；在日光灯、发光二极管、碘钨灯和激光4种光源下的藻红蛋白光漂白效果以激光最显著，240 μg/mL藻红蛋白10 min光漂白率可接近碘钨灯辐照240 min的光漂白率。

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