鲤鱼（Cyprinus carpio，Cyprinidae）ants基因及其对鳞片发育的影响

程安达 蒋丽 张保勇，3 王书 张研 刘永新方平 李恒德 孙效文，5

（1. 中国水产科学研究院水产生物应用基因组研究中心，北京 100141；2. 上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；3. 大连海洋大学生命科学与技术学院，大连 116023；4. 中国水产科学研究院学科发展处，北京 100141；5. 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所农业部淡水水产生物技术与遗传育种重点实验室，哈尔滨 150070）

ants（adenine nucleotide translocators），又称为ATP/ADP载体，可以调节ATP和ADP在线粒体内膜上的转运，所以在真核细胞的能量代谢中扮演着重要的角色［1-3］。ants作为线粒体内膜的组成部分，是线粒体中最丰富的一类蛋白。在呼吸条件下，线粒体内产生的ATP被转运到胞质来维持细胞活动，作为交换，线粒体外部的ADP被转运进入线粒体内，为在ATP合成酶的作用下ADP转变为ATP提供底物。ants属于线粒体载体家族（mitochondrial carrier family），这个家族可以进行各种各样的跨线粒体内膜的转运活动［3，4］。

ant家族的蛋白是由核基因编码的，表达之后定位到线粒体内膜中。营自由生活的细菌缺少与ant相似的分子，所以认为ant蛋白是由真核起源的广泛特异的载体家族进化来的［5］。大多数真核生物，包括单细胞真核生物，都具有多个ant基因。例如，出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）有3个ant基因（ant1，ant2和ant3）可以编码蛋白质［6］。其中，ant2是最主要的同工型，无论是呼吸过程还是厌氧发酵过程，都是广泛表达的［7］。ant1和ant3分别特异的在有氧和厌氧的条件下表达［6，8］。此外，ant2和ant3在丢失线粒体基因组的情况下仍能转运ATP来维持酵母的生存，而ant1则无此功能［9］。因此，不同的ant基因可能是被用来输入和输出ATP以有效地应对外部的营养和氧气条件的变化。有趣的是啤酒酵母（S. cerevisiae）的ant1基因具有比ant2和ant3更高的碱基累计替换率［10］，这与ant1基因在复制之后发生了功能上的变化的观点一致。

多细胞生物体中，在不同类型的组织，不同的发育时期以及不同的细胞增殖状态下，ant基因的表达都是不同的。大多数脊椎动物都可以表达3个不同的旁系同源的ant基因，它们表现出较高程度的序列相似性。其中，ant1（Slc25a4）主要在心脏和骨骼肌中表达，可以假定它可以适应心脏和骨骼肌中 ATP的快速代谢［11］。ant2（Slc25a5）和ant3（Slc25a6）在躯体组织中广泛表达，然而，ant2在哺乳动物快速生长的细胞中表达量较高，是有变化的，而ant3似乎是在所有组织中组成性的表达，其表达量无太多变化［12，13］。啮齿类动物缺少ant3基因，其ant2基因很可能同时承担了人类上ant2和ant3基因的功能［14，15］。在哺乳动物中，还存在第4种ant家族基因ant4（Slc25a31），它是在人和小鼠中首先被发现的［16-18］。它可以选择性地在成熟哺乳动物的睾丸和精子中表达，且在小鼠（mouse）精子发生过程中是必需的，但在鸟类、鱼类、蛙中却是缺少的［19］。ant4可以在成熟小鼠睾丸中的生殖细胞中特异表达，且在减数分裂时期，其表达量特别的高［20］。

鳞的形成是个极其复杂的生物学过程，可能需要成千上万的基因参与其中。ant作为ATP/ADP转运载体，可以为各个细胞的活动运送能量，它在鳞形成过程中可能发挥必不可少的作用。为了研究鳞形成的分子机制，我们利用Genefishing技术特异地钓取了鲤皮肤组织中的ant基因，经过克隆测序鉴定并进行初步的生物信息学分析来解析ant基因的基本特征，并通过原位杂交技术对该基因在鳞被形成过程中的表达进行分析，以此证明ant基因与鳞被发育的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

用于提取RNA的鲤鱼样品以及用来做原位杂交的幼鱼都来自于中国水产科学研究院黑龙江水产研究所松浦实验基地和无锡淡水研究中心。提取RNA的鲤鱼样品用新鲜的鲤鱼皮肤组织，Trizol试剂购自Invitrogen公司。反转录试剂盒购自东洋纺（Toyobo）公司。

1.2 方法

1.2.1 ant基因的钓取 利用Genefishing（Seegene，Korean）试剂盒对全鳞的普通鲤鱼建鲤（Common Carp）和普通鲤鱼天然选择突变体德国镜鲤（Germany Mirror Carp）的皮肤进行总RNA的差异筛选，试验步骤参照试剂盒的protocol。

1.2.2 ant基因CDS全长的克隆 刮掉鲤鱼的鳞片，取100 mg皮肤组织，用Trizol法提取RNA，DEPC水溶解RNA，利用分光光度计测定所提RNA的OD260/OD280值来判断RNA的质量，调节RNA的浓度为1 µg/µL，利用琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA的完整性。按照东洋纺RNA反转试剂盒的说明操作反转RNA为第一链cDNA。

根据斑马鱼ant基因的mRNA序列在5'UTR和3'UTR的保守区域分别设计目的片段包含CDS全长的上下游引物（Forward 5'-3'：CATTTCGAATCAGCCGGCATTC Reverse 5'-3'：GAAAACAGGTAGATTTTAGTAC），以反转得到的鲤鱼第一链cDNA为模板，进行PCR扩增。扩增程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s；54℃退火30 s；72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min。

PCR产物凝胶电泳后利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段，与EZ-T Vector连接，并转化TOP10感受态细胞，对重组质粒进行鉴定后，委托美吉公司进行测序。

1.2.3 生物信息分析 将测序获得的mRNA序列，利用NCBI上的ORF Finder预测其开放阅读框，以确定其起始密码子和终止密码子位点，从而获得CDS全长序列。利用MEGA5软件对测序得到的多条CDS序列进行ClustalW比对。利用MEGA5软件将CDS序列翻译成氨基酸序列，对其进行比对。从NCBI网站下载的不同分类地位的其它物种ant基因的氨基酸序列与测序得到的ant氨基酸序列一起利用MEGA5的邻接法构建进化树进行分析。

1.2.4 原位杂交检测基因在皮肤中的表达

1.2.4.1 反义RNA探针的制备 利用PrimerPremier5.0软件在该基因mRNA的特异区域设计片段长度为200 bp左右的一对引物（Forward 5'-3'：TGGGTAACTGCTTGGTGAAGATCTCC Reverse 5'-3'：ACCAGCAACAGCAGTCACAGTCTGA），以反转得到的鲤鱼第一链cDNA为模板，进行PCR扩增。扩增程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s；66℃退火30 s；72℃延伸15 s，30个循环；72℃延伸10 min。将PCR产物利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收，回收产物与EZ-T Vector连接，并转化TOP10感受态细胞。对重组质粒进行测序，鉴定目的片段插入方向。根据插入方向，对重组质粒进行线性化酶切（10 µg），选择T3或T7启动子进行体外转录。若反向插入，用下游NotⅠ酶切位点酶切，用T7启动子体外转录。若正向插入，用上游XhoⅠ酶切位点酶切，用T3启动子体外转录。以线性质粒为模版，体外合成地高辛标记RNA探针。20 µL反应体系如下：线性化模版DNA 1 µg，T3或T7 RNA聚合酶1 µL，RNase Inhibitor 1 µL，DIG-RNA dNTP 2 µL，5×Buffer 4 µL，去 RNase 水补充到 20 µL，37℃水浴2 h，稍离心后加1 µL DNaseⅠ37℃水浴20 min。取0.5 µL，进行电泳鉴定探针是否合成出来。用试剂盒对RNA进行产物纯化，纯化后的RNA probe 稀释到HYB+（稀释浓度，不同基因，所需probe不同。一般是20℃洗脱，1∶100稀释），用于原位杂交。制备正义RNA探针作为对照，其线性化酶切位点和体外转录方向的选择与反义探针的制备正好相反。

1.2.4.2 原位杂交所用鱼的饲养和前期处理 孵化黑龙江水产研究所松浦实验基地的人工授精的鲤鱼卵，开口饵料为草履虫，逐渐过渡到卤虫无节幼体和鲤鱼颗粒饲料喂养幼鱼，直到刚开始产生鳞片。收集刚开始产生鳞片的幼鱼，置于冰上将其杀死，利用4%的多聚甲醛进行固定，4℃过夜，逐渐过渡到无水甲醇中脱水，在甲醇中-20℃过夜。

1.2.4.3 原位杂交的步骤 原位杂交参照Westerfield［21］和 Jowett［22］所叙述的方法。将幼鱼从甲醇中逐渐过渡到PBST（DEPC水配制）溶液中，置换成HYB-溶液65℃水浴30 min，置换成HYB+溶液65℃预杂交6 h以上。置换成加入探针的HYB+溶液，65℃杂交15 h。回收探针，-70℃保存。在65℃下清洗幼鱼，洗去多余的探针，50%甲酰胺/2× SSCT 2次，每次1 h，2 X SSCT 1次，15 min，0.2 ×SSCT洗2次，每次1 h。室温下，用MABT洗3次，每次10 min，加入封闭液室温缓慢摇动封闭2 h。更换新鲜的封闭液，按1∶3 000比例加入耦联碱性磷酸酶的抗地高辛抗体（Anti-digoxigenin-AP Fab fragments），4℃缓慢摇动过夜。半对照不加入探针，但加入抗体，空白对照不加抗体。用含10%灭活羊血清的MABT缓慢摇动50 min，用MABT清洗3次，每次时间为2 h。用染色缓冲液（Staining buffer）平衡3次，每次10 min。加入含5 mmol/L左旋咪唑的显色液BM Purple AP Substrate，避光室温显色。根据具体情况，每隔一段时间观察幼鱼皮肤的显色情况。待显色完全后，用PBST洗3次，每次10 min，再用4%的多聚甲醛进行固定20 min。用PBST洗去多聚甲醛后置换成90%的甘油进行拍照，4℃保存。

2 结果

2.1 Genefishing技术钓取鳞片发育相关基因

利用Genefishing试剂盒中的20对引物对两组鲤鱼样品进行差异筛选，得到表达差异的片段后进行克隆测序。如图1所示，总共得到了7个差异产物（展示部分图）。用试剂盒中所带的简并引物ACP28在德国镜鲤中扩增出了一个约500 bp的特异条带，但同时在建鲤中是没有表达的；利用ACP29在镜鲤中扩增出了一个差异于建鲤的约700 bp的条带（其他未展示的几组引物筛选出来的差异表达产物在此不作介绍）。经过克隆测序鉴定，其中ACP28扩增出的产物是ant基因表达产物。

2.2 ant基因全长CDS的克隆和序列分析

图1 Genefishing筛选建鲤和镜鲤的皮肤总RNA的反转产物cDNA

提取鲤鱼皮肤组织的RNA，利用东洋纺反转录试剂盒将RNA反转合成第一链cDNA，以cDNA为模板，利用包含基因CDS全长的引物进行PCR扩增。PCR产物经连接、转化、克隆培养、挑取多个克隆测序，经ClustalW比对得到6条不同的CDS全长序列，分别表示为 CDS1、CDS2、CDS3、CDS4、CDS5和CDS6（图2）。利用NCBI上的ORF Finder预测其开放阅读框，发现ants基因CDS全长897 bp，可编码298个氨基酸。利用MEGA5软件将CDS序列翻译成氨基酸序列进行比对，发现有4条不同氨基酸序列，分别为a、b、c和d，其中CDS1、CDS5和CDS6编码相同的氨基酸序列a，而CDS2、CDS3和CDS4分别编码序列b、c和d。它们是高度保守的，但是仍存在部分差异（图3），两两相似性达到98%-99%，这些高度保守的相似性很高的类似蛋白很可能是由同一个基因同源分化来的，需要对其进行进一步的研究。物种间构建进化树进行分析，发现鲤皮肤中ant基因的氨基酸序列与斑马鱼ant2最为接近，说明由鲤鱼皮肤中钓取的ant基因是ant2的可能性较大。由图4聚类的结果（方框部分）可以看出，哺乳动物中的人（human），牛（bovine），小鼠（mouse）和大鼠（rat）的ant2亲源关系比较近，而与鱼类中的河豚（fugu），斑马鱼（zebrafish）和鲤相距较远，这也是符合进化关系的。

2.3 ant基因在皮肤中的表达

利用整体原位杂交的方法，制备地高辛标记的反义RNA探针，与皮肤中的mRNA进行特异杂交。结果发现ant基因在即将产生鳞片的皮肤处特异表达（图5 -H），表明ant基因参与到鳞的形成过程中。ant基因在鲤正在产生鳞片的皮肤处表达明显增强（图5 -H），而在皮肤的其它部位则表达较弱或不表达，正义探针作为负对照中没有杂交信号（图5- I），这个结果表明ant2基因可能在鳞片发生及其维持过程有重要作用，这与ant2在哺乳动物快速生长的细胞中表达量较高，且有变化的［12，13］观点一致。ant是一种线粒体中含量十分丰富的能量转运载体蛋白，它可以将线粒体产生的ATP运出，为细胞的生命活动提供能量。由此可以推测，ant基因在鳞片部位的表达可能是与鳞被形成过程中，产生鳞片的细胞或者维持鳞片发育的皮肤细胞由于其生理活动的加强而需要更多的能量有关，从而需要较多的能量载体蛋白，而这种转运蛋白本身具有特异性。

图2 建鲤皮肤中钓取的6条不同的ants基因CDS全长序列

图3 建鲤皮肤中钓取的4条不同的ants基因氨基酸序列

图4 建鲤中钓取的4条氨基酸序列与其它物种ants序列构建进化树

图5 原位杂交检测ANTs基因在不同时期胚胎和幼鱼皮肤中的表达

在我们的研究中，利用Genefishing技术采用多对特异的简并引物对一组有鳞和散鳞的样品进行转录产物的差异筛选，用40对引物（该文中未展示）共得到了40个差异转录产物，我们将对其逐一进行功能解析，本研究中为ant基因。为了验证Genefishing的效率，把筛选出来的差异表达基因返回到德国镜鲤和建鲤中进行RT-PCR验证（图6），证明阳性率可达90%（40/44）。因此Genefishing筛选差异基因具有阳性率高，筛选效率高的特点。

3 讨论

图6 RT-PCR验证差异产物在德国镜鲤和建鲤中的表达情况

鳞片作为皮肤重要的附属物，与哺乳动物的毛发、指甲等一样，是由皮肤原始干细胞经过定向分化而来，具有重要的生物学意义。鱼类的鳞片除了减少游动产生的摩擦力、维持体型骨架的基本功能之外，同时还具有很重要的防御病原菌侵害的功能。根据鳞片的形态不同，可以将鱼类的鳞片分为楯鳞，硬鳞和骨鳞，其中骨鳞又分为圆鳞和栉鳞，这些形态各异的鳞片的发育都是有其固定的模式，这就是我们所说的鳞片的模式形成和形态建成。鳞片发生及发育的分子机制一直以来是水产生物学家非常感兴趣的生物学问题，但由于鱼类的研究囿于其基因组相对庞大，基因组成比较复杂，进化上较为古老等原因一直比较落后。迄今为止，已经克隆并且证实与鱼类的鳞片发生及发育相关的基因比较有代表性的有 fgf/fgfr［21］，apoE［22］，EDA/EDAR［23，24］，SHH［25，26］等，而且他们利用的是传统的分子遗传学方式筛选出了鳞片发育紊乱的突变体，该种方法准确但是通量较低，而且由于鱼类多倍体的特征，使得突变表型由于冗余或者相同基因功能的互补而不能快速地定位鳞被相关基因。目前得益于测序技术的发展，转录组学的发展尤为迅速而且价格低廉，我们可以从转录表达产物为突破口，高通量、快速地挖掘鳞被相关因子，然后进行功能研究，不失为一种高效的策略。

我们特异地从皮肤中钓取ant基因，进行多次测序，最终得到了4条不同的氨基酸序列，它们氨基酸差别不大，有的甚至只相差一个氨基酸。经简单的生物信息学分析，发现它们与斑马鱼ant2基因的相似性最高，猜测它们很可能同属于ant2，它们之间的不同可能是由碱基突变或SNP造成的。由进化树可以看出哺乳动物以及鸟类等高等脊椎动物的ant基因归类明显，而鱼类与其相比，显得有些混乱，尽管如此，可以明显地发现鲤皮肤中钓出的ant基因明显的与斑马鱼ant2基因归在一起，所以是ant2的可能性最大。

钓取皮肤中的ant基因，虽然得到4条不同的氨基酸序列，但是它们的相似度极其的高，很可能都属于ant基因。在哺乳动物中ant3基因广泛表达。由此推知ant3在鲤鱼的皮肤中很可能也是表达的。但是却没有被钓出，一方面可能是由于挑取测序的克隆较少，没有达到饱和，所以漏掉了某些ant基因；另一方面可能是ant3确实不在皮肤处表达，则说明鲤鱼与哺乳动物中的ant基因特化的程度差别很大。斑马鱼是二倍体鱼类，而鲤鱼是经过了四倍体的二倍体化的过程，鲤鱼的染色体数是斑马鱼的两倍。目前斑马鱼已经发现有3个ant基因，分别是ant1、ant2和ant3。由此推测，若是将鲤鱼中的ant基因全部找出，很可能是6条或者是更多。

经整体原位杂交检测发现ant基因确实在正要产生鳞片的皮肤处高表达，而在其它部位则表达较弱或不表达，说明ant基因确实是在鳞形成的过程中发挥了一定的作用。由于ant基因序列的相似度太高，无法用原杂的方法区分参与到鳞形成过程的是ant基因的哪一个同工型；但是，通过原杂发现在皮肤中ant基因的表达有强弱变化。在形成鳞的部位ant的表达量要明显高于还未生长鳞的部位，这与ant2的特点相符。ant2在哺乳动物快速生长的细胞中表达量较高，且有变化，而ant3似乎是在所有组织中结构性的表达，其表达量无太多变化［12，13］，所以，参与到鳞形成过程中的ant基因很可能是ant2。在鳞形成过程中，细胞生长增殖等生命活动较旺盛，需要更多的能量供应，也就需要表达更多的ant基因来提供足够的ATP/ADP转运载体。另外，ant2除了在鳞片着生部位强烈特异表达之外，在受精后10 h的外包处开始强烈特异表达，以后的表达逐渐减弱至无，而后又在受精后48 h的体节中特异超强表达，这些结果说明ant2在体节发育中的功能是通过其精确受控的时空表达而实现的。

4 结论

ants基因在建鲤（全身被鳞）和德国镜鲤（部分被鳞）两种鱼的皮肤处表达存在显著差异，说明ants基因很可能与鳞被的形成发育相关。

利用RT-PCR技术对其皮肤中的ants进行钓取，得到6条不同的ants的CDS序列，分别编码4条不同的蛋白产物。4个ants表达产物与斑马鱼ant2基因最为相似，且明显聚类为ant2，说明皮肤中表达的这些ants很可能是ant2。

ant2在受精后4.5 h和6 h不表达，从受精后10 h开始在外包处强烈特异表达，在受精后12 h的胚胎中很弱表达，在受精后24 h的体节中特异强烈表达，在受精后48 h胚胎无表达，但是在着生鳞片的部位特异强烈表达，而在皮肤的其它部位则表达较弱或者不表达。说明ant2基因确实与鳞被的形成和发育有关。

以上的结果表明，ant2基因可能是通过不同的转录产物（isoforms）在精细调控鳞片的发育。

致谢：本研究所用试验材料得到无锡淡水研究中心俞菊华研究员、黑龙江水产研究所张晓锋和曹顶臣副研究员的帮助，原位杂交实验技术受到中国科学院动物所王强研究员的帮助，在此一并表示感谢。

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