超声辅助固相萃取-HPLC法测定不同地区缴获鸦片样品中生物碱

刘翠梅，白燕平

（1．中国人民公安大学，北京 100038；2．公安部禁毒情报技术中心，北京 100193）

超声辅助固相萃取-HPLC法
测定不同地区缴获鸦片样品中生物碱

刘翠梅1，2，白燕平2

（1．中国人民公安大学，北京 100038；2．公安部禁毒情报技术中心，北京 100193）

目的 本文建立了超声辅助固相萃取-HPLC法定量测定缴获鸦片样品中吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可汀5种生物碱并同时检出6种未知化合物的方法。采用主成分分析法区分不同地区缴获的鸦片样品。方法 采用超声辅助固相萃取法提取生物碱，XDB-C18（5μm×4.6mm×250mm）色谱柱，流动相为10mM的1-庚烷磺酸钠（pH 3.2）和乙腈，梯度洗脱，紫外检测器检测。结果 该方法的定量限为0.58~2.78 mg/kg。添加水平在0.2～1.5mg/mL范围内，平均加标回收率为81.0%～99.2%，相对标准偏差为1.6%～5.0%。结论 本方法重现性好、定量准确，满足定量检测鸦片中生物碱含量并对不同产地鸦片进行分类的需要。

超声辅助固相萃取；主成分分析；鸦片；生物碱

鸦片是一年生草本植物―罂粟未成熟蒴果经割伤果皮后，渗出之白色乳汁干燥凝固而得。生鸦片中含有30多种生物碱，其中含量较高的是吗啡、可待因、那可丁、罂粟碱、蒂巴因，此外还含有那碎因、隐晶碱、7-氧二氢蒂巴因、东罂粟碱、牛心果碱、可旦民碱、劳丹尼定、隐晶碱、劳丹素、去甲基劳丹素等其它含量较低的生物碱[1]。

由于受到气候、土壤、水源等自然环境的影响，生长于不同地域罂粟的品质有所不同，从而造成不同地域鸦片中所含生物碱的种类和含量有很大的差别。制毒分子从鸦片中提取得到粗制吗啡，将粗制吗啡二乙酰化反应后制得海洛因。由于受到提取、合成、纯化方法的限制，或基于“制毒成本”的考虑，制毒分子制得的粗制吗啡和海洛因中往往残留多种鸦片类生物碱，鸦片中生物碱的差异在相应的粗制吗啡和海洛因中也有所体现。因此检测鸦片中的生物碱，建立不同地区鸦片样品的生物碱含量数据库，对区分鸦片的产地、研究粗制吗啡提取批次、海洛因合成批次、进一步细化海洛因的产地都有很重要的意义。

鸦片样品中生物碱的萃取方法主要有液液萃取法、固相萃取法、超声辅助固相萃取法。液液萃取法所需消耗溶剂量大，步骤繁琐。超声辅助固相萃取提取结合了超声提取时间短、效率高、操作简便和固相萃取所需溶剂量小、可选择性地去除基质干扰、萃取效率高的优点，是一种较为理想的生物碱萃取方式[2]。

鸦片生物碱的检测方法主要有气相色谱法（GC）[3]、液相色谱法（HPLC）[4-5]、毛细管电泳法（CE）[6-7]、液相色谱质谱联用法（HPLC-MS）[1]，本文采用反相液相色谱法对鸦片样品中的5种已知和6种未知生物碱进行了检测，并尝试采用主成分分析法对不同地区缴获的鸦片样品进行了分类。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

岛津DGU-20A高效液相色谱仪，超声波清洗器（KQ 3200E），IKA 涡旋混合器，固相萃取仪（MμLti-SPE M08），氮吹仪（Anke TDL-60B），离心机（MTN-2800D）阳离子交换固相萃取柱（WatersoasisMCX1cc）。

1-庚烷磺酸钠（纯度99.0%，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，Fisher）；其它试剂均为分析纯。超纯水由Millipore纯水系统制备。

盐酸吗啡、磷酸可待因、罂粟碱、那可汀、蒂巴因均购自国家药品生物制品检定所。

1.2 对照品溶液配制

将吗啡、可待因、罂粟碱、那可汀、蒂巴因配成10mg/mL储备液，在5℃储存备用。

1.3 方法

1.3.1样品前处理

鸦片样品于55℃真空干燥，干燥后用玛瑙研钵研磨均匀。

准确称取150mg鸦片样品，加入7.5mL提取溶剂，超声 30min，离心，移取上清液，在滤渣中加入7.5mL提取溶剂同法提取第二次，合并两次上清液。取1mL上清液上阳离子交换固相萃取柱。上样前分别用1mL的甲醇和1mL0.1M的盐酸对固相萃取柱进行活化。上样后分别用1mL 0.1M盐酸和1mL甲醇对固相萃取柱进行淋洗，并抽干溶剂。用氨化甲醇（甲醇-28%氨水，95∶5）1mL，0.5mL 洗脱两次，收集洗脱液，将洗脱液用氮吹仪40℃吹干，加入1mL甲醇，超声溶解，过0.45μm滤膜，进HPLC分析。

1.3.2 HPLC分析条件

色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18（5μm×4.6mm×250mm），柱温：40℃，进样体积：3μL，流速：1mL/min，检测波长：280nm。

流动相：（A）10mM 1-庚烷磺酸钠（1.0g溶于390mL水中），用磷酸调pH为3.2；（B）乙腈。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2 结果与讨论

2.1 流动相的pH选择

流动相的pH会改变生物碱的解离状态，从而改变其保留时间，为此本文考察了不同pH条件下5种生物碱保留时间的漂移。实验尝试了2.8、3.0、3.2、3.4、3.6共5种pH条件，结果表明pH为2.8、3.0、3.2、3.4时，保留时间变化不大，保留时间相对标准偏差（RSD）分别为：吗啡0.62%，可待因0.26%，蒂巴因0.42%，罂粟碱0.39%，那可汀0.74%。pH为3.6时5种化合物的保留时间有较大改变。最终选定的pH为3.2。

2.2 萃取溶剂的考察

不同溶剂对生物碱的提取效率不同。本文考察了甲醇、80%甲醇/水，50%甲醇/水，2.5%乙酸，5%乙酸这5种常见的提取溶剂的提取效率。称取50mg鸦片样品，分别加入5mL提取溶剂，超声30min，5000r/min离心10min，取上清液过0.45μm滤膜，进HPLC进行分析。

结果表明甲醇的提取效率高于80%甲醇/水和50%甲醇/水。2.5%乙酸和5%乙酸的提取效果相当。当选用甲醇为提取溶剂时，蒂巴因、罂粟碱、那可汀的提取效率最高，选用2.5%或5%乙酸时，吗啡、可待因的提取效率最高。

2.3 洗脱溶剂的考察

不同洗脱溶剂对生物碱的洗脱效率也会有差异。本文考察了采用2.5%乙酸和甲醇为萃取溶剂时，二氯甲烷/丙酸、氯仿/异丙醇、氨化甲醇三种洗脱溶剂洗脱效果。

方法A：萃取溶剂：2.5%乙酸（上柱前先用氨水调节上清液pH为9.0）；洗脱溶剂：二氯甲烷/丙酸（二氯甲烷 ∶丙酸=9∶1）

方法B：萃取溶剂：2.5%乙酸（上柱前先用氨水调节上清液pH为9.0）；洗脱溶剂：氯仿/异丙醇（氯仿∶异丙醇=3∶1）

方法C：萃取溶剂：2.5%乙酸，洗脱溶剂；氨化甲醇（甲醇 ∶28%氨水=95∶5）

方法D：萃取溶剂：甲醇，洗脱溶剂；氨化甲醇（甲醇：28%氨水=95：5）

图1 不同萃取和洗脱溶剂效果图

由图1结果表明，同样采用2.5%乙酸作为萃取溶剂时，二氯甲烷/丙酸（A）、氯仿/异丙醇（B）、氨化甲醇（C）三种洗脱体系中氨化甲醇的洗脱效果最好。当选用氨化甲醇洗脱体系时，萃取溶剂在上样前省去了调节pH这一繁琐的步骤，操作过程更加简便。

方法C和D分别选用2.5%乙酸和甲醇作为萃取溶剂，均采用氨化甲醇作为洗脱溶剂。结果表明选用方法C时测得的吗啡、可待因含量较高，选用方法D时测得的蒂巴因、罂粟碱、那可汀含量较高。

2.4 方法的线性范围与检出限

将吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可汀配制成0.01mg/mL，0.05mg/mL，0.1mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL，2mg/mL的混合标准曲线，进样分析，以样品峰面积为纵坐标，样品浓度为横坐标，获得标准曲线，见表2。在所测的浓度范围内，5种化合物的线性关系良好（r≥0.9991）。

按照国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）的定义，检出限以信噪比S/N〉3计，定量限以S/N〉10计，将混合生物碱标准品稀释后进样，得到样品的检出限和定量限。结果见表2。

表2 各生物碱的线性范围和检出限

2.5 精密度和加标回收率的考察

取某一鸦片样品作为基质样品，分别添加0.2mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL的3个不同浓度水平的混合标准溶液，按1.3.1方法进行前处理，每个浓度水平平行做6次。将测得的加标后样品中生物碱的含量值扣除样品本身生物碱的含量值得到添加生物碱的测定值，该测定值与理论添加值的比值即为加标回收率。各化合物平均加标回收率为85%～109%，RSD为1.6%～5.0%，结果见表3。

表3 样品加标回收率和相对标准偏差 n=6

3 样品测定

选取缴获地分别为云南、甘肃、河北、贵州、内蒙5个地区的共58份鸦片样品，采用甲醇为萃取溶剂，按1.3.3方法进行前处理，进HPLC分析。

图2 实际鸦片样品的色谱图

图2为测得的某一鸦片样品的色谱图，从图2色谱图可以看出，除了吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可汀5种已知的生物碱外，还同时检出6未知生物碱类化合物（色谱图中用1-6标记），这6种未知化合物存在于多数鸦片样品中，且不同样品含量差异较大。在后期的工作中，笔者会尝试采用液相色谱质谱联用仪、核磁等手段对这6种未知生物碱进行定性分析。

表4为各缴获地5种生物碱的平均含量，河北、内蒙样品中吗啡的平均含量最高，云南样品中吗啡的平均含量最低。贵州样品中罂粟碱、那可汀的平均含量最高。

表4 鸦片样品5种生物碱平均含量汇总表 单位：%

采用主成分分析法对11种生物碱的峰面积数据进行计算，采用主成分1和主成分2作图，分类结果见图3。

图3 不同地区鸦片样品PCA分类结果

58份样品大体分为四组，第一组为内蒙和河北样品，从图3中也可以看出，与其它样品相比内蒙和河北样品中吗啡的平均含量最高、罂粟碱和那可汀的平均含量最低，吗啡和罂粟碱的平均含量数值高度一致。第二组为贵州样品，这些样品的罂粟碱、那可汀平均含量最高。云南的样品大致分为差异显著的两组，这两组样品间罂粟碱和那可汀的含量有较大差异。甘肃样品较分散，散落在河北与贵州样品之间。

4 结论

本文建立了超声辅助固相萃取-液相色谱分析不同地域缴获鸦片样品中生物碱的方法。超声辅助固相萃取法快速、高效、消耗萃取溶剂少、操作简便，是较为理想的萃取方法。文中考察了几种常见的萃取和洗脱溶剂，结果表明采用甲醇或2.5%乙酸进行萃取，氨化甲醇进行洗脱的操作简便、效率超高。本方法可定量测定缴获鸦片样品中吗啡、可待因、罂粟碱、那可汀和蒂巴因，并同时检出6种未知生物碱。采用利用主成分分析法分析这11种生物碱数据，可将58份不同地域缴获的鸦片样品大致分成差异明显的4类。

在后期的工作中，笔者将采用该方法开展对近三年全国缴获的鸦片样品的分析工作，初步建立我国缴获鸦片样品生物碱含量数据库。逐渐增加的鸦片样品的生物碱信息将对现有分类结果进一步验证或修正，从而实现采用鸦片样品的生物碱分析结果判别鸦片样品产地的目的。

[1]Ira S.Lurie，Steven G.Toske.Applicability of ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for heroin profiling[J].J.Chromatogr.A， 2008， 1188（2）：322–326.

[2]周小华，汪群杰.固相萃取技术与应用[M].北京：科学出版社，2010：12-14.

[3]Furmanec D.Quantitative gas chromatographic determination of the major alkaloids in gum opium[J].J Chromatogr.，1974， 89（1）：76-9.

[4]Kayo Yoshimatsu， Fumiyuki Kiuchi， Koichiro Shimomura，et al.A rapid and reliable solid-phase extraction method for high-performance liquid chromatographic analysis of opium alkaloids from papaver plants[J].Chem.Pharm.Bull.2005，53（11）：1446-1450.

[5]L.Krenn， S.Glantschnig， U.Sorgner.Determination of the five major opium alkaloids by reversed-phase high-performance liquid chromatography on a base-deactivated stationary phase[J].Chromatographia， 1998， 47（1-2）： 21-24.

[6]Ali Reza Fakhari，Saeed Nojavan， Samad Nejad Ebrahimi，et al.Optimized ultrasound-assisted extraction procedure for the analysis of opium alkaloids in papaver plants by cyclodextrin-modified capillary electrophoresis[J].J.Sep.Sci.2010，33（14）：2153-2159.

[7]Ira S.Lurie， Sini Panicker， Patrick A.Hays， et al.Use of dynamically coated capillaries with added cyclodextrins for the analysis of opium using capillary electrophoresis[J].J.Chromatogr.A， 2003， 984（1）：109-120.

Determination of Opium Alkaloids by HPLC with Ultrasound Assisted Solid Phase Extraction and Its Application in Source Identification

LIU Cui-mei1，2，BAI Yan-ping2
（1.Chinese People’s Public Security University，Beijing 100038，China；2.The Drug Intelligence and Forensic Center of Minister of Public Security，Beijing 100193，China）

Objective To develop a rapid and reliable method for simultaneous determination of morphine， codeine， thebaine，papaverine，noscapine and 6 other unknown compounds in seized opium samples by high performance liquid chromatography with ultrasonic assisted solid phase extraction.Method Ultrasonic assisted solid phase extraction was used to extract alkaloids.Target analytes were separated on a XDB-C18 column （5 μm×4.6 mm×250 mm）， and were gradiently eluted with the binary mobile phase containing 10 mM sodium heptane-1-sulphonate （pH3.2） and acetonitrile.Results LOQ of different alkaloids ranged from 0.58 to 2.78 mg/mL.Recoveries at 0.2-1.5 mg/mL ranged from 81.0%-99.2%and RSD%was 1.6%-5.0%.The PCA divided 58 seized samples into 4 groups.Conclusion The established method is of high reproducibility and accuracy.It can be applied to determining the alkaloids in opium samples and discriminating different sources of opium.

ultrasound assisted solid phase extraction；principle component analysis（PCA）；opium；alkaloid.

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2013.02.008

1671-2072-（2013）02-0031-04

2012-11-11

国家科技支撑计划（2011BAK04B06）

刘翠梅（1983—），女，博士研究生，主要从事毒品原产地和关联性判别分析研究。E-mail：liucuimei123@yahoo.cn。

卓先义）

鉴定实践Forensic Practice