吲哚-2,3-二酮抗菌作用研究

殷津津 宋丽阳 杨 杰 岳 旺 张继国

(1.青岛大学医学院药学系，山东 青岛 266021； 2.泰山医学院药理学教研室，山东 泰安 271016)

细菌感染是临床上常见的病症，但现有的大多抗菌药物存在特异性低、毒性大、易耐药等缺点，而且大多数抗菌西药价格昂贵。从海洋生物次生代谢产物中已筛选出大量抗菌活性成分[1]，但临床应用的先导化合物仍较少。

吲哚-2，3-二酮(靛红，isatin，ISA)是来自于龙虾并维持其生存所必需的一种天然海洋活性物质[2]，现已证明它也是存在于海洋生物、中药青黛和人体内的天然活性物质，为成分单一的橙红色有机天然物质，化学结构明确，单体已可合成。实验研究已表明，ISA有抗炎[3]、抗病毒[4]、抗肿瘤[5]、免疫增强[6]等作用，但未见ISA在抗菌作用方面的报道，本研究通过吲哚-2,3-二酮的体内外抗菌实验，研究ISA的抗菌作用。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

金黄色葡萄球菌(ATCC6032)、大肠埃希菌(ATCC8099)、吲哚-2,3-二酮片、二甲基亚砜、纯化水、培养皿、无菌试管、营养肉汤、眼科镊子、玻璃棒、无菌棉签、培养箱、游标卡尺、磺胺嘧啶、纯化水、西黄蓍胶。

1.2 实验动物

健康昆明种小鼠，由青岛市药检所实验动物中心提供。

1.3 实验方法

1.3.1体外抑菌试验

采用琼脂扩散法，将各供试菌液标化，15 min内接种于培养基上，接种方法是用灭菌棉签沾取菌液,在平板上向一个方向均匀涂布,然后将平皿转动60°，再涂布1 次，重复3次, 最后沿平板边缘涂布1 周。加盖放置5 min，待平皿面稍干，用无菌眼科镊子将经过提取物浸润的药敏片均匀间隔贴于琼脂培养基表面，并轻压纸片，使其与培养基接触良好，放入37℃恒温培养箱中，培养18～24 h，取出，观察抑菌圈大小，测量并记录结果。测量抑菌环时，选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行测量,用游标卡尺测量抑菌环的直径，并记录测量数据。

1.3.2最小抑菌浓度(MIC) 测定试验

采用试管稀释法。根据体外抑菌试验结果结合提取物的溶解性,取无菌试管10支(15 ×100 mm),每管加入适宜的肉汤(接种金黄色葡萄球菌、大肠杆菌用营养肉汤) 2 ml ,在第1 管加入配好的提取物原液(12 mg/ ml) 2 ml ,然后吸取2 ml 至第2 管,混匀后再吸取2 ml 至第3 管,如此连续倍比稀释至第8 管,并从第8 管中吸取2 ml弃去,第9 管为不含提取物的生长对照,只加入肉汤2 ml ,第10 管为提取物对照,只加入提取物原液2 ml ,不加肉汤和细菌。使各管提取物浓度依次为原液浓度的1/2 、1/4 、1/8 、1/16 、1/32 、1/64 、1/128 、1/256。在每管内加入制备好的菌悬液各0.1 ml。第1 管至第8 管提取物浓度依次为6.00、3.00、1.50、0.75、0.375、0.1875、0.09375、0.046875 mg/ ml。接种完毕后,各试管加塞,置37℃恒温培养箱中,培养18～24 h，试验重复3 次。结果判定：以肉眼观察,不发生混浊变化的最高提取物稀释倍数为该提取物的MIC。

1.3.3最小杀菌浓度(MBC) 测定试验

选用已经定出MIC 的各组,将组内所有清晰无菌生长的试管培养液各取出100 μl，加入到适宜的琼脂培养基上，用灭菌L 型玻璃棒涂布均匀，置37℃恒温培养箱中,培养18～24 h，重复3 次。结果判定：以菌落数不超过5 个的最低提取物浓度为该提取物的MBC。

因吲哚-2，3-二酮不溶于水，微溶于二甲基亚砜，而二甲基亚砜本身有一定的杀菌作用 。为了证明二甲基亚砜溶剂对吲哚-2，3-二酮抑菌结果有无影响，将二甲基亚砜纯试剂与吲哚-2，3-二酮含量为12mg/ml的二甲基亚砜溶液，按相同稀释倍数稀释成不同浓度作对照试验。

1.3.4动物分组与处理

将吲哚-2，3-二酮和磺胺嘧啶溶于1.25%的西黄蓍胶，配成吲哚-2，3-二酮10、25、62.5 mg/kg的混悬液，磺胺嘧啶配成200 mg/kg的混悬液。取小鼠100只，随机均分成5组，每组20只：西黄蓍胶组、ISA低中高剂量组(ISA 10、25、62.5 mg/kg)和磺胺嘧啶组(200 mg/kg)，分别灌胃给药(每只0.25 ml)，连续9天。于第9天给药后40 min，各组小鼠10只腹腔注射金黄色葡萄球菌菌液1.0 ml(1×109CFU/ml)，另外10只腹腔注射大肠杆菌液1.0 ml(1×109CFU/ml)，观察小鼠的死亡情况，连续5天。

2 结 果

2.1 体外抑菌实验

可看出，当ISA浓度为75 mg/ml时，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌产生抑制作用。结果见表1。

表1 不同浓度吲哚-2，3-二酮对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用

2.2 最小抑菌浓度实验

可看出，当ISA浓度为750 ;μg/ml时，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均无生长，说明ISA对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为750 μg/ml。见表2。

表2 吲哚-2，3-二酮对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC

注：+表示有细菌生长，-表示抑菌。

2.3 MBC

可看出，当ISA浓度为3000 μg/ml时，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均无生长，说明ISA对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度为3000 μg/ml。还观察到二甲基亚砜溶剂稀释至ISA含量为1.5 mg/ml的相同倍数时没有抑菌(对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌均相同)效果。本试验所用ISA的最高稀释浓度为1.5 mg/ml，故二甲基亚砜溶剂对ISA的抑菌效果无影响。结果见表3。

体内抗菌试验结果显示，25 mg/kg ISA可使大肠杆菌和金黄色葡萄球菌导致的小鼠死亡率降低40%。见表4。

表 3 吲哚-2，3-二酮对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MBC

注：+表示有细菌生长，-表示抑菌。

表4 吲哚-2，3-二酮对感染金黄色葡萄球菌和大肠杆菌小鼠的保护作用

注：分子为每组死亡小鼠数，分母为每组小鼠总数。

3 讨 论

由细菌、病毒、支原体、衣原体等多种病原微生物所致的感染性疾病遍布临床各科，其中细菌性感染最为常见[7]，因此抗菌药物也就成为临床最广泛应用的药物之一。但现有的大多抗菌药物存在特异性低、毒性大、易耐药等缺点。目前在生物次生代谢产物中已筛选出大量抗菌活性成分，但临床应用的先导化合物仍较少。对大量的海洋动物提取物进行抗细菌实验表明，鲍鱼、牡蛎、硬壳蛤和某些腹足动物提取物中的大分子化合物，在体内、体外均显示出抗菌活性。本研究通过体内外抗菌实验，证明了海洋活性物质吲哚-2,3-二酮具有抗菌作用，其最低抑菌浓度(MIC)在大肠杆菌及金黄色葡萄球菌均为750 μg/ml，最低杀菌浓度(MBC)在大肠杆菌及金黄色葡萄球菌均为3000 μg/ml。并且25 mg/kg吲哚-2，3-二酮可使大肠杆菌和金黄色葡萄球菌导致的小鼠死亡率降低40%。

吲哚-2，3-二酮具有良好的抗菌作用，并且其毒性低，副作用小[7]，在制备抗菌药物方面有良好的应用前景。吲哚-2，3-二酮作为一种结构明确的天然海洋活性物质，毒性低，具有良好的抗菌消炎作用，这是目前人工合成抗菌药物所不具有的优点，有着巨大的新药开发价值。

[1] 刘平怀,刘洋洋,陈德力,等.ASE联合微孔板刃天青显色法快速筛选海洋抗菌活性物质[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(15):176-179.

[2] Glover V, Halket JM, Watkins PJ，et al. Isatin: identity with the purified monoamine oxidase inhibitor tribulln[J]. J Nenrochem, 1988,51:656

[3] 黄霞.海洋抗生物质吲哚-2，3-二酮抗菌及抗炎作用的研究[D].青岛大学,2008.

[4] 陈达.2，3-吲哚醌抗病毒作用研究[D].青岛大学,2006.

[5] 王蕾,曹静,鞠传霞,等.2,3-吲哚醌抗肿瘤作用研究[J].中国药理学通报,2007,23(8):1052-1056.

[6] 侯江涛,张婷婷,毛小红,等.2,3-吲哚醌在大鼠体内的药代动力学研究[J].泰山医学院学报,2011,32(2):84-87.

[7] 王建英,李延兰,张雪莲,等.269例细菌性感染疾病抗菌药物临床分析[J].中华医院感染学杂志,2010,20(14):2127-2129.

[8] 李永春.内源性活性物质2，3-吲哚醌毒理研究[D].青岛大学,2004.