人支架蛋白IQGAP1-shRNA慢病毒载体的构建及鉴定*

张 芮 王一兵 林 莉 王法刚 李 强 曹永倩

(1.山东医学高等专科学校病理教研室，山东 济南 250002；2. 山东大学附属省立医院烧伤整形美容外科, 山东 济南 250021)

作为一种细胞骨架蛋白，支架蛋白IQGAP1在细胞的多种生物学行为中发挥重要功能，通过调节多种信号传导途径在肿瘤细胞迁移、侵袭和增殖中扮演重要的角色；并与多种恶性肿瘤的发展、转移和预后密切相关。为探讨IQGAP1在肿瘤细胞转移侵袭中的作用机制，我们构建针对IQGAP1基因的RNA干扰(RNAi)的慢病毒载体，高效、特异、稳定地抑制IQGAP1基因的表达。

1 材料与方法

1.1材料

PCR用试剂primer(生工生物工程上海有限公司)，Positive clone测序(Invitrogen公司)，Taq polymerase(NEB公司)，DMEM+ 10% 胎牛血清(GIBICO公司)，高纯度质粒抽提试剂盒(QIAGEN公司)，DNA ladder、EcoR I、T4 DNA ligase(Fermentas公司)。

1.2慢病毒干扰载体的构建

针对目的基因靶基因序列，根据Genbank中人IQGAP1(NM_003870)的基本信息，设计4个RNA 干扰靶点序列，分别为No.1: CAGTAATCTACATTTCCAT, No.2: CATCCACTTACCAGGATAT, No.3:GGATGAAGCCGCATTACATGC, No.4:GCCCAGCAATATCAGAGAAGA。经BLAST检索，确认除IQGAP1基因以外的已知基因无同源性，分别设计并合成4对shRNA寡聚单链DNA，退火成双链后插入到慢病毒载体中，构建4 个shRNA慢病毒重组质粒。shRNA经退火、酶切、回收后与引物连接，把连接产物全部加入感受态细胞中进行转化。过夜培养后，挑取若干个单菌落，测序鉴定阳性克隆。

1.3慢病毒载体沉默效果的验证

用QIAGEN高纯度质粒抽提试剂盒制备构建4条shRNA慢病毒载体质粒，将状态良好，处于对数生长期的空白细胞293T细胞，按照每孔5×105个细胞接种于3.5 cm 培养皿，24 h细胞覆盖70%～80%左右进行转染，48 h收集细胞抽提蛋白，采用Western blot检测目的蛋白的表达情况，进而判断shRNA慢病毒载体对不同靶点的干扰效果。

1.4慢病毒的包装和病毒滴度的测定

抽取shRNA载体及其辅助包装原件载体质粒，使用HG transgene reagent 将构建好的慢病毒shRNA载体及其辅助包装原件载体质粒共转染进293T 细胞，转染10～12 h 后加Enhancing buffer，接着8 h 后更换新鲜培养基，继续培养48 h 后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，在293T 细胞中测定病毒滴度。

2 结 果

2.1阳性克隆测序结果

经过比对，重组克隆中插入片段序列与设计的oligo序列完全一致，因此IQGAP1-shRNA 慢病毒载体构建成功(图1,2)。

图1 pGMLV-SB1RNAi 慢病毒载体图谱

IQGAP1-shRNA1

IQGAP1-shRNA2

IQGAP1-shRNA3

IQGAP1-shRNA4

2.2Western blot 方法检测转染后IQGAP1基因的表达水平

以β-actin作为内参对照，Western blot检测转染后IQGAP1蛋白表达条带。可见实验组IQGAP1蛋白表达量减少，IQGAP1-shRNA3沉默效果明显，为有效靶点(图3)，以此进行病毒包装。

图3 转染后IQGAP1基因的表达水平

2.3慢病毒shRNA感染细胞96 h后部分孔的荧光照片 如图4。

图4 慢病毒shRNA感染细胞96 h后荧光照片

A为含有10×10-9ml的慢病毒原液，B为含有10×10-10ml的慢病毒原液

IQGAP1-shRNA3 病毒感染293T细胞，B号孔中观察表达绿色荧光的细胞至少为20个，则病毒的滴度为:20TU/10×10-10ml =2×1010TU/ml,可以作为贮存液用于后续的研究。

3 讨 论

近年来IQGAP1蛋白在恶性肿瘤中的研究是肿瘤侵袭转移领域的一大热点，高表达的IQGAPl蛋白能够破坏细胞间的粘附连接，降低细胞间的粘附力，并且显著增强细胞运动能力[1]，而这二者在肿瘤细胞的侵袭转移中处于核心地位。IQGAP1作为Rac1/Cdc42信号通路和肌动蛋白动力的调节者[2]，被认为是细胞迁移的重要调节者[3-5]。同时通过影响E-cadherin介导的上皮细胞间的粘附连接，降低细胞间的粘附性[6]。细胞间粘附力降低，可以使肿瘤细胞更容易从细胞集落中脱落下来，进入血流和周围组织。

IQGAP1 在结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤组织中表达明显增高[7-8]，并且在恶性胶质瘤病人中已作为判断预后的重要标志之一。在侵袭性高的卵巢腺癌组织中IQGAP1的表达比在腺瘤或交界性瘤组织中的表达明显增高[9]。在胃癌病人中，IQGAP1的低表达提示预后良好[10]。Jun J等[11]利用免疫组化的方法观察鼻窦内翻性乳头状瘤(IP)、鼻窦鳞状细胞癌(SCC)及二者兼有的标本(IPcSCC)，发现SCC和IPcSCC组织中IQGAP1的表达量比IP组织和非肿瘤性疾病中明显增高；在SCC病人中，IQGAP1的表达与局部复发和远处转移密切相关。因此通过各种手段沉默敲除或下调IQGAP1的表达，研究其对肿瘤转移侵袭能力的影响是倍受重视的研究思路。但目前关于应用RNA干扰手段沉默表达IQGAP1的报道还比较少见，因此我们构建了IQGAP1-RNAi的慢病毒载体系统，用于转染IQGAP1表达较高的肿瘤细胞，观察其对肿瘤细胞转移侵袭能力的影响。

RNA干扰是由双链RNA(dsRNA)转化成小分子干扰RNA(siRNA)所介导的一种基因沉默的过程[12]，小片段的siRNA可以诱导高效的基因沉默。因此利用RNAi来阻断目的基因的表达，是目前基因治疗和基因功能研究的热点之一[13-14]。

细胞基因修饰的常用载体有非病毒转移载体和基因修饰病毒载体，前者包括质粒、寡核苷酸等，但存在转移效率低、细胞膜损伤等缺点。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒和慢病毒等，完全缺失致病基因的慢病毒(lentivirus)载体具有很高的安全性[15]，对于分裂或非分裂细胞均有较高的感染能力，能够使目的基因整合到宿主的基因组，为靶基因的沉默稳定、持久提供了有力保障[16-17]。可显著提高RNAi的抑制效率，慢病毒载体作为新一代高效表达载体推进了肿瘤的基因治疗。

本实验设计出GC含量在32%～48%的4个shRNA序列，连接慢病毒载体pGMLV-SB1，测序鉴定后，将构建重组的载体和慢病毒包装质粒共同转染293T细胞，通过Western blot证明在293T细胞中成功抑制了IQGAP1的表达，并在293T细胞中成功包装出entivirus-IQGAP1-shRNA病毒，测定病毒滴度达2×1010TU/ml；为RNAi用于靶向IQGAP1的基因治疗提供了有效的siRNA序列,为肿瘤的基因诊断和治疗开启了一扇窗。

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