新疆巴州牦牛种群线粒体DNA遗传多样性及其系统发育分析

王兰萍，耿荣庆，常 洪，冀德君，李永红，常春芳

（1.盐城师范学院 生命科学与技术学院，江苏 盐城224051；2.扬州大学 动物科学与技术学院，江苏 扬州225009）

牦牛是高寒地区特有牛种，主要繁衍生息在我国青藏高原及周围3 000 m以上的高寒地区，善走陡坡险路和雪山沼泽，能游渡江河激流，有“高原之舟”之称。牦牛分为野牦牛（Bos grunniens mutus）和家牦牛（Bos grunniens），在动物分类学上隶属于偶蹄目（Artiodactyla）、反刍亚目（Ruminatia）、牛科（Bovidae）和牛亚科（Bovinae），但牦牛在属级分类地位上尚无统一定论［1-10］。巴州牦牛产区位于新疆维吾尔自治区东南部，天山南麓，阿尔金山北麓，其中心产区位于巴音郭楞蒙古自治州和静县及和硕县的高山地带，以和静的巴音布鲁克、巴伦台地区为集中产区。巴州牦牛是在产区特定自然条件下，适应高寒草甸草原和高寒草场环境，经过当地蒙古族牧民长期选育形成的牦牛类群，为牧民生产乳、肉、毛、皮等产品，是当地畜牧业经济中重要的畜种。

本研究在测定新疆巴州牦牛种群线粒体Cyt b基因全长序列的基础上，分析种群的遗传多样性水平，并引用其它牛种的Cyt b基因序列，探讨新疆巴州牦牛的系统发育关系，为种质资源的保护和利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集

在新疆维吾尔自治区和静县巴音布鲁克地区，以中心产区典型群简单随机抽样方法，采集17头巴州牦牛（Bos grunniens）血液样本，颈静脉抽取血样，肝素钠溶液抗凝。采集的抗凝血样于-70℃冷冻保存。

1.2 总DNA提取、PCR扩增及测序

采用苯酚-氯仿法提取血液样本总DNA，TE溶解后-20℃保存。

以牛线粒体基因组序列（GenBank登录号NC＿006853）设计引物用于Cyt b基因全序列扩增。上、下 游 引 物 分 别 为：P1 5′-CCATAAATAGGT GAAGGTTTGG-3＇和P2 5′-TTGATGGTGAGAC TGCAGTT-3′。引物委托上海生工生物工程有限公司合成。

PCR扩增体系为50μL体积，包括10×Buffer 5μL，25mmol／L MgCl24μL，2.5 mmol／L d NTPs 4μL，10 pmol／μL 上、下游引物各1μL，5 U／μL Taq DNA 聚合酶0.3μL，100 ng／μL DNA模板1 μL，剩余体积用灭菌超纯水补足。PCR扩增程序为：95℃预变性2 min；94℃变性40 s、55℃退火40 s，72℃延伸90 s，共32个循环；72℃延伸8 min，4℃保存。

1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，用凝胶回收试剂盒回收纯化，直接送上海生工生物工程有限公司双向测序。

1.3 序列数据处理与分析

所有序列使用DNAstar软件编辑、校对和排序，根据测序峰图辅以手工调整。DnaSP4.0［11］软件计算群体的单倍型多样性和核苷酸多样性。以Clustal X1.83［12］软件进行多序列比对，系统发育分析采用 MEGA5.0软件［13］，分别用邻接法（Neighbor joining，NJ）和最大简约法（Maximum parsimony，MP）构建系统进化树，自展法（Bootstrap analysis）1000次重复抽样估计系统树中结点的置信值。

除了本次测定的巴州牦牛Cyt b基因单倍型序列以外，用于构建系统进化树的序列还包括另外两部分：一是本实验测定的普通牛（GenBank登录号EU807948）、瘤牛（GenBank登录号EU096518）、大额牛（GenBank登录号EU807956）、亚洲水牛（Gen-Bank登录号EU807960）Cyt b基因单倍型序列，另一部分引用新疆野牦牛（GenBank登录号AY955225、AY955226）、牦 牛 （GenBank 登 录 号AY684273、AY374124、GQ464246、GQ464248、GQ464252、GQ464256、GQ464258、GQ464259、GQ464266、GQ464305、GQ464310、JF946750）、林牛（GenBank登录号 AY689189）、印度野牛（Gen-Bank登录号GU324988）、爪哇牛（GenBank登录号DQ459558）、欧洲野牛（GenBank登录号 Y15005）、美洲野牛（GenBank登录号AF036273）和非洲水牛（Gen Bank登录号D82888）等牛种Cyt b基因单倍型序列。

2 结果与分析

2.1 Cyt b基因序列特征和单倍型分布

对测序获得的巴州牦牛线粒体Cyt b基因序列比对分析后，去除首尾两端测序碱基序列，获得用于分析的Cyt b基因序列全长均为1 140 bp。17头巴州牦牛个体中共检测到4种单倍型类型（表1），单倍型多样性为0.331，核苷酸多样性为0.00102。

表1 巴州牦牛Cyt b基因单倍型及其变异特征Table 1 Haplotypes and variation characteristics of Cyt b gene of Bazhou yak

2.2 分子系统发育分析

以不同牛种的线粒体Cyt b基因单倍型序列为基础数据，采用Kimura双参数模型，使用NJ法和MP法构建分子系统树（图1）。NJ法和MP法构建的分子系统发育树的拓扑结构基本一致，巴州牦牛Cyt b基因的4种单倍型明显有两个分支，一支（Gen Bank 登 录 号 EU807949、EU807950、EU807951）是与其它家牦牛的单倍型聚在一起，另一支（GenBank登录号EU807952）与新疆野牦牛的单倍型聚在一起，而且具有较高的自展置信值支持（NJ树中为99，NP树中为73），表明新疆巴州牦牛有2个母系起源。

3 讨 论

基于线粒体Cyt b基因部分序列的系统发育分析表明，巴州牦牛可能具有2种母系起源［14］。本研究的结果显示，从线粒体遗传的角度来看，巴州牦牛有2个母系起源，一类拥有家牦牛血统，另一类拥有野牦牛血统。巴州牦牛与新疆野牦牛线粒体Cyt b基因共同聚为一类，可能存在两种原因：一种是两者在较早的世代具有共同的祖先，使得它们曾经拥有共同的祖先序列，并且在漫长的进化历程中巴州牦牛仍然保留着祖先序列的基本特征；另一种推测是野牦牛到巴州牦牛可能存在着线粒体DNA渐渗。

对于家牦牛的起源，各国学者都比较认同牦牛的单一起源学说，即原始牦牛是家牦牛和野牦牛的共同祖先，现在的家养牦牛是由野牦牛驯化而来［15-17］。因此，巴州牦牛与新疆野牦牛完全可能拥有早期共同祖先的线粒体序列特征，从而与本研究的聚类结果相吻合。

为了提高生产性能和改进遗传品质，在巴州牦牛的改良过程中，曾经实施过引进野牦牛冻精、捕捉野牦牛犊牛进行人工饲养驯化与杂交改良以及巴州半野血牦牛良种繁育基地等项目，而且在部分地区经常发生公野牦牛进入家养牦牛群中配种的事例［18］。这些为野牦牛与巴州牦牛的线粒体DNA渐渗提供了可能，使得出现巴州牦牛与新疆野牦牛线粒体Cyt b基因聚为一类的现象。

图1 基于Cyt b基因单倍型构建的牛种间分子系统发育关系Fig.1 The molecular phylogenetic trees based on haplotypes of Cyt b gene of bovine species

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