贺俊杰,刘璇,陈彦,曹伟,袁菱 (.江苏省中医药研究院,国家中医药管理局中药释药系统重点研究室,江苏南京008;.南京中医药大学附属中西医结合医院,江苏 南京0046)
灯台叶是夹竹桃科鸡骨常山属乔木灯台树(Alstoniascholaris(L.)R.Bro.)的干燥叶,性味甘、淡、平,具有清热解毒、消肿止痛、平喘止咳、截疟、发汗、健胃等作用[1]。灯台叶主要含有生物碱、黄酮、三萜类等有效组分,其中鸭脚树叶碱(picrinine)和瓦莱萨明碱(vallesamine)是其代表性生物碱成分[2],具有较好的抗炎镇痛、止咳平喘的药理作用[3-4]。本课题组在前期的研究中对灯台叶所含的总生物碱进行了提取纯化,本研究采用大鼠在体肠灌流模型[7-8]考察了总生物碱中鸭脚树叶碱和瓦莱萨明碱的肠吸收情况,以期为灯台叶中生物碱的合理应用提供生物药剂学依据。
Agilent 1200高效液相色谱仪,包括柱温箱、在线脱气机、四元泵及二极管阵列检测器(美国Agilent公司);MettlerToledo分析天平(Mettler Toledo分析仪器有限公司);Anke离心机TGL-16G(上海安亭科学仪器厂);数显恒温搅拌循环水箱HH-60(常州国华仪器厂);pH 计(Metller-Toledo分析仪器有限公司);恒流泵PHD2000 Infuse/withdraw Pump(美国 Harvard Apparatus Inc.)。
灯台叶购于云南植物技术有限公司(批号20100520),经南京中医药大学吴德康教授鉴定为夹竹桃科鸡骨常山属灯台树(Alstoniascholaris(L.)R.Bro.)的干燥叶;鸭脚树叶碱(纯度≥98%,中国食品药品检定研究院,批号11697200802);瓦莱萨明碱(本实验室自制,纯度≥98%,批号20111125);AB-8型大孔吸附树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司);氯化钙(上海市奉贤奉城试剂厂);硫酸镁,氯化钾(无锡市民丰试剂厂);磷酸二氢钾,磷酸氢二钠(南京化学试剂一厂);葡萄糖(河北葡糖糖厂);碳酸氢钠(南京化学试剂有限公司);HEPES(北京拜尔迪生物公司);甲醇、乙腈、三乙胺为色谱纯;水为纯净水;其他试剂均为分析纯。
实验动物:SD雄性大鼠,体质量为200~250 g,上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,许可证号:SCXX(沪)2011-0005。
2.1 溶液的配制
2.1.1 Hank’s平衡盐溶液(HBSS)的配制 准确称取硫酸镁0.1 g,氯化钾0.4 g,氯化钠9.164 g,磷酸二氢钾0.06 g,磷酸氢二钠0.126 g,碳酸氢钠0.37 g,氯化钙0.14 g,葡萄糖5.5 g,HEPES 5.96 g,依次溶解于超纯水中,定容至1 000 mL,依试验需要,用1 mol·L-1的盐酸、5 mol·L-1的氢氧化钠调节pH值。
2.1.2 鸭脚树叶碱和瓦莱萨明碱混合储备液的配制 精密称取10.14 mg鸭脚树叶碱和10.20 mg瓦莱萨明碱置同一个10 mL量瓶中,用无水乙醇溶解定容至刻度,即得3.0mmol·L-1的鸭脚树叶碱和瓦莱萨明碱对照品储备液。
2.1.3 灯台叶总生物碱的制备 取灯台叶500 g,加10倍量85%乙醇回流提取2次,每次2 h,滤过,合并滤液,回收乙醇至浸膏。将灯台叶浸膏上AB-8大孔树脂吸附,先用40%乙醇洗去杂质,然后再用60%乙醇洗脱,收集60%乙醇洗脱部位,回收溶剂,减压干燥,得灯台叶总生物碱组分12.1 g。经HPLC测定鸭脚树叶碱在总生物碱中的含量为0.44%,瓦莱萨明碱在总生物碱中的含量为0.97%。
2.1.4 灯台叶总生物碱供试液的配制 分别精密称取总生物碱1.0,1.5,2.0g至10 mL量瓶中,用无水乙醇溶解定容至刻度,从中精密吸取2.5 mL,用pH7.4的HBSS溶液稀释定容至250 mL,即得浓度分别为1.0,1.5,2.0mg·mL-1总生物碱供试液,其中鸭脚树叶碱的浓度分别为13.0,19.5,26.0 μmol·L-1,瓦莱萨明碱的浓度分别为22.0,33.0,44.0μmol·L-1。
2.2 肠灌流液中鸭脚树叶碱及瓦莱萨明碱含量的测定[5-6]
2.2.1 色谱条件 色谱柱:ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm,5μm);流动相:乙腈-0.1%三乙胺水溶液(38∶62);柱温:30℃;检测波长:287 nm;流速:1.0mL·min-1;进样量:20μL。在此色谱条件下,瓦莱萨明碱的保留时间约为8.8 min,鸭脚树叶碱的保留时间约为10.6 min,HPLC图谱见图1。
图1 HPLC图Fig 1 HPLC chromatograms
2.2.2 鸭脚树叶碱和瓦莱萨明碱在不同pH值的HBSS溶液中稳定性 精密量取鸭脚树叶碱及瓦莱萨明碱的混合储备液适量,分别用pH值5.5,6.6,7.4,8.0的HBSS溶液稀释成10,20,30μmol·L-13个浓度的溶液,置于37℃恒温水浴中,分别于0,1,2,4,8,12,24 h取样测定含量,以药物残留百分比自然对数值对时间画图,按一级动力学方程求得不同pH值时鸭脚树叶碱及瓦莱萨明碱的降解反应常数,结果见表1。结果表明3个浓度的鸭脚树叶碱和瓦莱萨明碱在pH5.5~8.0范围内降解较少,在pH7.4的HBSS溶液中24 h内稳定性最好。
表1 鸭脚树叶碱及瓦莱萨明碱在不同pH值的HBSS溶液中的降解反应常数Tab 1 Response constant of picrinine and vallesamine in HBSS of different pH
2.2.3 线性关系考察 将混合对照品储备液用无水乙醇分别稀释成0.625,1.25,2.50,5.00,10.00,20.00,30.00,60.00μmol·L-1的系列标准溶液,取上述各溶液800μL,13 000 r·min-1离心15 min后取上清液进样。以浓度(μmol·L-1)为横坐标,峰面积为纵坐标,进行线性回归。计算回归方程为:鸭脚树叶碱Y=0.209 3X-0.012 8,r2=0.999 9;瓦莱萨明碱Y=0.205 4X-0.024 7,r2=0.999 6。表明鸭脚树叶碱和瓦莱萨明碱在0.625~60.00μmol·L-1范围内线性关系良好。
2.2.4 精密度考察 分别取“2.2.3”项下10,20,30μmol·L-13个浓度的溶液,以一天内测定同一样品6次的结果计算日内精密度,以连续6 d测定同一样品的结果计算日间精密度。鸭脚树叶碱3个浓度 日 内 精 密 度 RSD 分 别 为0.52%,0.36%,0.47%,日间精密度 RSD 分别为1.01%,0.96%,0.91%;瓦莱萨明碱3个浓度日内精密度RSD分别为0.79%,0.93%,0.75%,日间精密度 RSD分别为1.22%,0.76%,0.45%,表明本方法日间、日内精密度良好。
2.2.5 回收率测定 精密吸取鸭脚树叶碱和瓦莱萨明碱贮备液适量,用空白肠灌流液配制成低、中、高(10,20,30μmol·L-1)3个浓度的溶液,在上述色谱条件下测定,以标准曲线计算浓度,以测定浓度与加入浓度之比计算回收率。结果3个浓度的鸭脚树叶碱的回收率分别为(99.2±0.7)%,(99.31±0.22)%,(99.34±0.31)%(n=5);瓦莱萨明碱的回收率分别为(99.5±1.0)%,(98.6±0.5)%,(99.0±0.8)%(n=5),符合生物样品含量测定要求。
2.3 大鼠在体肠灌流试验[7-9]实验前将大鼠禁食16 h(自由饮水),肌肉注射0.5 g·mL-1乌拉坦溶液麻醉(2.8 mL·kg-1),固定,沿腹中线切口4 cm 打开腹腔,分别在十二指肠、空肠、回肠、结肠4个肠段(十二指肠段为距幽门1 cm处开始往下取10 cm;空肠段为幽门15 cm处开始往下取10 cm;回肠段为从回盲连接处2 cm开始上行取10 cm;结肠段为从回盲连接处2 cm开始往下取10 cm)插入导管,用线结扎固定,插管后将小肠部分小心放回肠腔,尽可能避免肠段的卷曲和扭结。切口用等渗生理盐水浸润的纱布覆盖以保湿,用37℃恒温的生理盐水将肠内容物冲洗干净。将进口管隔离,在37℃循环水浴中保持灌注温度恒定。取预热至37℃的供试药液50 mL,以0.2 mL·min-1的体积流量灌流,平衡45 min后,每隔30 min分段收集流出液,并精确称定流出液量,实验结束后,将4段肠段剪下并放入生理盐水中测量各肠段长度。
2.4 样品处理 分别精密移取各肠段不同时间段的流出液800μL,置于1.5 mL离心管中,加入200 μL乙腈,涡旋混匀,13 000 r·min-1离心15 min后,取上清液进样测定。
2.5 数据分析 采用重量法校正肠壁对水分吸收的误差,肠壁有效渗透系数(Peff*)计算公式如下。
式中Co和Cm代表进口浓度和出口浓度,D为扩散系数,L为小肠长度,Q为流速,Gz值为一个测量因素,对流速、小肠长度等因素进行修正。
2.6 不同浓度灯台叶总生物碱中鸭脚树叶碱及瓦莱萨明碱各肠段吸收情况 不同浓度灯台叶总生物碱中鸭脚树叶碱及瓦莱萨明碱在各个肠段的Peff*结果见表2。可见鸭脚树叶碱和瓦莱萨明碱在各肠段的Peff*值均>1,说明鸭脚树叶碱和瓦莱萨明碱在4个肠段吸收均较好,且按十二指肠、结肠、空肠和回肠的顺序依次降低。经SPSS 13.0统计软件分析,结果表明鸭脚树叶碱和瓦莱萨明碱在各肠段之间的Peff*两两比较有显著性差异(P<0.05),说明鸭脚树叶碱和瓦莱萨明碱在肠道内的吸收部位有选择性,主要的吸收部位在十二指肠和结肠。而不同浓度的同一肠段2种生物碱吸收均无显著性差异,提示鸭脚树叶碱和瓦莱萨明碱的肠吸收不受自身浓度的影响,可能主要表现为被动扩散机制。
表2 不同浓度总生物碱中鸭脚树叶碱和瓦莱萨明碱不同肠段的Peff*(±s,n=4)Tab 2 Peff*of picrinine and vallesamine of different total alkaloid concentrations in different intestinal segments(±s,n=4)
表2 不同浓度总生物碱中鸭脚树叶碱和瓦莱萨明碱不同肠段的Peff*(±s,n=4)Tab 2 Peff*of picrinine and vallesamine of different total alkaloid concentrations in different intestinal segments(±s,n=4)
肠段 质量浓度/mg·mL-1 Peff*鸭脚树叶碱 瓦莱萨明碱1.0 4.50±0.85 4.43±0.26十二指肠 1.5 4.74±0.48 4.04±0.58 2.0 4.56±0.48 4.39±0.63 1.0 2.67±0.64 2.23±0.65空肠 1.5 2.94±0.88 2.43±0.34 2.0 3.55±0.58 2.54±0.39 1.0 1.51±0.42 1.43±0.23回肠 1.5 1.98±0.48 1.47±0.26 2.0 2.32±0.41 1.86±0.38 1.0 3.69±0.92 3.27±0.88结肠 1.5 3.93±0.98 3.12±0.10 2.0 4.04±1.03 3.49±0.29
本实验采用大鼠肠灌流模型考察了鸭脚树叶碱和瓦莱萨明碱在大鼠肠道内的吸收特性。在建立HPLC方法测定鸭脚树叶碱及瓦莱萨明碱的含量时发现鸭脚树叶碱紫外光谱有287,235,210 nm3个吸收峰,瓦莱萨明碱有287,220 nm2个吸收峰,由于220 nm和210 nm2个波长接近末端吸收,使用三乙胺溶液作为流动相时噪音较大,对测定结果影响较大,而287 nm波长检测时基线较平稳,因而选择287 nm作为检测波长,保证了含量测定结果的可靠性。
由于大鼠在体单向肠灌流模型保证了肠道内分泌和内部神经的完好无损,也保证了血液淋巴液的正常供应,对肠道的内环境破坏很小,与口服给药后肠道的吸收过程较接近,吸收速率较稳定,与人体有很好的相关性,因此本实验采用该模型考察了灯台叶总生物碱提取物中鸭脚树叶碱和瓦莱萨明碱在大鼠肠道的吸收情况,结果鸭脚树叶碱和瓦莱萨明碱在大鼠肠道吸收均较好,Peff*值在4个肠段均大于1.0,尤其在十二指肠和结肠吸收较好。实验结果提示灯台叶中的活性生物碱口服有利于吸收,对灯台叶进一步研制成口服制剂提供了生物药剂学依据,减少了剂型设计的盲目性,为提高灯台叶有效成分的生物利用度以及临床合理应用提供了参考。
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