ALDH1、EpCAM及Ki67 mRNA在大肠癌患者循环肿瘤细胞中的表达及意义

黄 芳， 钱国伟， 刘俊杰， 白 津， 裴冬生， 郑骏年

大肠癌术后的局部复发和远处转移是影响5年生存率的重要原因。肿瘤转移理论认为，循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)与肿瘤的血行转移有直接关系，但只有极少数CTC具有转移潜能[1-3]。肿瘤干细胞理论认为肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)是肿瘤转移和复发的直接原因。本研究将具有干细胞标志的EpCAM、ALDH1及增殖标志Ki67作为目的基因，采用定量PCR-Taqman探针法检测其在大肠癌患者外周血中的表达量，初步探索其与大肠癌的临床、病理表现的关系及意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2010年7月1日至2010年12月1日，徐州医学院附属医院普外科术前经肠镜及病理证实的55例大肠癌患者，未接受过任何抗肿瘤治疗和免疫治疗，其中男24例，女31例；60岁及60岁以上24例， 60岁以下31例；腺癌44例，非腺癌11例；肿瘤直径≥5 cm的27例；浸润深度达到或超过浆膜层39例；神经脉管侵犯27例；有癌结节10例；有淋巴结转移20例；远处转移5例；高、中、低分化的例数分别为10例、36例、9例； TNM分期(参照AJCC 2002版TNM分期标准)0～Ⅳ期病例数分别为：5、8、21、16、5；血清CEA增高14例；血清CA199增高10例。对照组样本来自56例健康志愿者，年龄18～80岁。本研究中临床标本的采集均经徐州医学院附属医院伦理委员会批准。

1.2 试剂和材料

血液总RNA提取试剂盒购自北京TIANGEN公司；反转录试剂盒购自大连Takara公司，pGEM-T Easy Vector购自美国Promega公司，定量PCR反应试剂盒购自美国Invitrogen公司；细胞株：人结肠癌细胞系SW620购自中科院上海细胞库，人急性淋巴细胞性白血病细胞系Sup-B15购自北京中原公司。EpCAM 和Ki67引物及Taqman探针序列均来自文献，ALDH1引物和Taqman探针采用Primer 3软件设计(F：5′TCCAGCCCACAGTGTTCTCTAAT3′，R：5′GATTTGCTGCACTGGTCCAA3′,Probe：5′TTACAGATGAGATGCGCATT3′，80bp)，所用引物和探针均由美国Invitrogen公司合成。

1.3 方法

1.3.1 样本采集标准 术前采集新鲜的肘静脉血7 mL，前5 mL用于其他项目检查。后2 mL 用EDTA抗凝，在采集后2小时内从全血中提取单个核细胞的总RNA并冻存于-80 ℃保存。

1.3.2 定量PCR阳性标准模板构建 使用RT-PCR法从培养的细胞(SW620和Sup-B15细胞株)中获取EpCAM、ALDH1及 Ki67基因的目的片段，将其分别插入pGEM-T载体，构建三个质粒pGEM-T-ALDH1、pGEM-T-EpCAM和pGEM-T-Ki67，并分别按108、107、106、105、104、103copies/μL梯度稀释，制作荧光定量PCR的标准曲线。

1.3.3 检测方法 用荧光定量PCR Taqman探针法检测样本中靶基因ALDH1、EpCAM、Ki67 mRNA的表达，规定每例样本取400 ng总RNA加入20 μL反转录体系反转录成cDNA。取2 μL的cDNA做定量PCR检测模板，以95%正常值范围作为参考值。

1.3.4 统计学方法 采用SPSS16.0软件进行统计分析，对不满足正态性和方差齐性的计量资料采用两独立样本非参数检验，各检测指标与临床各病理参数的关系采用多重线性回归分析，各检测指标之间的关系采用简单线性回归分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 ALDH1、EpCAM、Ki67 mRNA的表达

定量荧光PCR Taqman法检测大肠癌组外周静脉血中ALDH1、EpCAM、Ki67 mRNA(每40 ng总RNA中)的表达量均高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。大肠癌组ALDH1、EpCAM、Ki67mRNA阳性表达率分别为10.9%(6/55)、41.8%(23/55)、45.5%(25/55)。

表1 大肠癌组和健康对照组ALDH1、EpCAM、Ki67 mRNA(每40 ng总RNA中)的中位拷贝数

2.2 ALDH1、EpCAM、Ki67 mRNA表达量与大肠癌临床病理参数之间的关系

多重线性回归分析大肠癌组ALDH1、EpCAM、Ki67 mRNA表达量与临床病理参数的关系显示，ALDH1与浸润深度(P=0.022)及淋巴结转移(P=0.048)相关；EpCAM与TNM分期(P=0.013)及远处转移(P=0.033)相关；Ki67与性别、年龄、肿瘤大小等临床病理参数均无相关性，见表2。

表2 Ki67、EpCAM 、ALDH1mRNA的表达量与大肠癌临床病理参数之间的关系

2.3 Ki67、EpCAM、ALDH1间的关系

简单线性回归分析，表明EpCAM和ALDH1之间有线性回归关系，Ki67和ALDH1之间有线性回归关系，但Ki67和EpCAM之间无线性回归关系，见表3。

表3 Ki67、EpCAM与ALDH1之间的线性关系

3 讨论

定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、定量准确、操作安全等优点，现已广泛应用于肿瘤微转移的检测和诊断。研究表明用定量PCR分析CTC的表达与用Cell Search检测的效率相当(80%～85%)[4]。另有多组研究证实用qRT-PCR分子学方法来检测肿瘤患者外周血中的微小转移有助于评估复发风险及预测和判断疗效[5-6]。

由于CTC数量很少且很难捕获，大多数传统的分离策略都会丢失掉部分的肿瘤细胞[2]，如何能在外周血中准确的检测到其中极少数具有异处成瘤能力的CTC是目前CTC研究领域的巨大挑战[3]。EpCAM是一种上皮细胞黏附分子，在上皮来源的肿瘤组织中强表达，具有维持癌干细胞增殖、自我更新、非贴壁依赖性生长及侵袭的能力[7]。ALDH1作为结肠癌CSC标记物比CD44+/CD133+特异性更强[8]。Ki67作为细胞增殖标记可用来评估CTC及CSC的增殖能力。本研究采取先裂解全血中红细胞的办法获得单个核细胞，避免分选过程中造成CTC的丢失，之后用FQ-PCR Taqman法检测大肠癌的两个重要的干细胞标志EpCAM和ALDH1的表达，以期能从分子生物学水平检测出CTC中真正有临床意义的微转移。

本研究55例大肠癌患者中ALDH1阳性率10.9%(6例)，与肿瘤干细胞数量少、表达率低的特点相符。ALDH1与浸润深度(P=0.022)及淋巴结转移相关(P=0.048)，EpCAM与TNM分期(P=0.013)及远处转移相关(P=0.033)，提示EpCAM阳性、ALDH1阳性的CTC可能具有一定的CSC潜能，具有一定的恶性侵袭能力和引起转移的能力，可能在这部分的CTC中存在着一些具有“种子”能力的CSC即转移肿瘤干细胞(MCSC)。

维持静止休眠状态是CSC保持其干细胞功能的关键，也是其逃避抗增殖化疗的方式[9]。本研究显示在ALDH1阳性患者中有83.3%(5/6)患者表达Ki67，且Ki67与ALDH1有线性回归关系(P=0.000)，提示外周循环CTC的增殖能力可能随着CSC标志物ALDH1表达的增高而增高。但仅依据分子生物学的检测还不能直接推断CTC整体增殖能力的增高完全与CSC的增多有关。根据干细胞理论，随着CSC的增多，将会伴随着更多具有有限增殖能力的由CSC分化的各个阶段肿瘤细胞产生，必然会有Ki67升高。这暗示CTC中Ki67 及ALDH1表达的增高可能在一定程度上间接反应了CSC的激活状态。

细胞增殖异常与肿瘤的关系一直受到广泛关注，但是关于CTC的增殖状态目前存在争议[10]。本研究显示55例大肠癌中Ki67阳性的有25例(45.5%)，Ki67的表达水平与性别、年龄、肿瘤大小等临床病理参数均无相关性，这从分子生物学水平说明只有部分大肠癌患者的CTC是具有增殖能力的，但是这种增殖能力并不能完全代表CTC的恶性侵袭能力。

综上所述，定量PCR法检测大肠癌循环肿瘤细胞中ALDH1、EpCAM、Ki67 mRNA的表达作为一种简便可行的分子生物学方法，可以为大肠癌患者的分期、预后及个体化治疗提供有价值的信息。

[1] Nelson NJ.Circulating tumor cells: will they be clinically useful[J].J Natl Cancer Inst,2010,102(3):146-148.

[2] Kaiser J.Medicine.Cancer’s Circulation Problem[J].Science,2010,327(5969): 1072-1074.

[3] Nagrath S,Sequist LV,Maheswaran S,et al.Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology[J].Nature,2007,450(7173):1235-1239.

[4] Helo P,Cronin AM,Danila DC,et al.Circulating prostate tumor cells detected by reverse transcription-PCR in men with localized or castration-refractory prostate cancer: concordance with CellSearch assay and association with bone metastases and with survival[J].Clin Chem,2009,55(4): 765-773.

[5] Tewes M,Aktas B,Welt A,et al.Molecular profiling and predictive value of circulating tumor cellsin patients with metastatic breast cancer: an option for monitoring response to breast cancer related therapies[J].Breast Cancer Res Treat,2009,115(3): 581-590.

[6] Koyanagi K,Bilchik AJ,Saha S,et al.Prognostic relevance of occult nodal micrometastases and circulating tumor cells in colorectal cancer in a prospective multicenter trial[J].Clin Cancer Res,2008,14(22): 7391-7396.

[7] Munz M,Baeuerle PA,Gires O,et al.The emerging role of EpCAM in cancer and stem cell signaling[J].Cancer Res,2009,69(14): 5627-5629.

[8] Huang EH,Hynes MJ,Zhang T,et al.Aldehyde dehydrogenase 1 is a marker for normal and malignant human colonic stem cells(SC) and tracks SC overpopulation during colon tumorigenesis[J].Cancer Res,2009,69(8): 3382-3389.

[9] Lianidoul ES,Mavroudis D,Sotiropoulou G,et al.What’s new on circulating tumor cells A meeting report[J].Breast Cancer Research,2010,12(4):307.

[10] Pantel K,Brakenhoff RH,Brandt B,et al.Detection,clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells[J].Nat Rev Cancer,2008,8(5):329-340.