新型醛基化海藻酸钠抗凝血涂层物制备及性能评价

李金友 李 彤 高文卿 于美丽 胡晓旻 许 晋 陆海滨 于广栋

（天津医科大学研究生院，天津 300170）2（天津市第三中心医院，天津 300170）3（天津市人工细胞重点实验室，天津 300170）

引言

随着体外循环技术的发展，体外循环管路的血液相容性和生物相容性受到了医学界的高度重视。自发现肝素涂层人工材料表面能够改善材料的抗凝性能和生物相容性，并具有减少体外循环肝素化肝素用量、降低输血率和减少并发症等优点以来［1-3］，各种肝素涂层方法不断涌现，主要分物理缠绕和化学固定两大类，目前应用较广的是通过终点固定法结合肝素［4］。终点固定法肝素涂层管路有着良好的抗凝血性能，但是由于肝素原料及进口套包价格昂贵，在一定程度上限制了其应用。

海藻酸钠是一种聚阴离子大分子多糖，具有良好的生物相容性和一定的抗凝性能［5］，价格低廉容易获得，广泛应用于医学材料和生物工程方面［6，7］。本研究通过高碘酸钠氧化获得多醛基的OSA，利用终点固定法将OSA涂层物固定到体外循环用PVC管道内表面（PVCS），对OSA涂层管道进行生物相容性和血液相容性评价，并与美敦力肝素涂层组（PVCM）、空白对照组（PVCC）进行比较，以期获得具备优异生物相容性和良好抗凝性能的新型OSA涂层管路。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

材料：BCA蛋白试剂盒（CAS：120509，上海生工），人血清白蛋白（10 g/50 mL，Behring GmbH，德国），人血清纤维蛋白原（CAS：9001-32-5，Calbiochem，德国），海藻酸钠（CAS：9005-38-3，SIGMA-ALDRICH，美国）高碘酸钠（CAS：7790-28-5，SIGMA-ALDRICH，美国）。

仪器：红外分光光度计（NICOLET 6700，Thermo，美国），紫外分光光度计（UV-2800，日立，日本），凝血自动分析仪（STA-R Evolution®，Diagnostica Stago，法 国），血细胞分析仪（ADVIA2120，SIEMENS，德国），扫描电镜（FEI台式，美国）

1.2 方法

1.2.1 OSA的制备及氧化度测定

1.2.1.1 海藻酸钠氧化处理

依照文献［8］方法，制备 OSA。配质量分数为2％的海藻酸钠水溶液100 mL，然后按不同摩尔比（1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶10、1∶12）加入高碘酸钠，避光磁力搅拌下反应24 h，然后加入0.4 mL乙二醇终止反应15 min，终止液加入4 g NaCl，混匀5 min，按体积比1∶5倒入无水乙醇中沉淀、析出，将沉淀物取出，真空抽吸，自然干燥。干燥后样品再溶，后透析过夜，透析后样品液经冷冻干燥后得终产物OSA。

1.2.1.2 海藻酸钠24 h氧化度测定

按文献［9］，采用碘化钠-淀粉糊精法制作标准曲线。取氧化24 h的海藻酸钠溶液2.5 mL，迅速加入工作液2.5 mL，避光作用50 min后在480 nm处测定吸光度值，最后根据标准曲线计算出高碘酸钠消耗量。

式中，N为高碘酸钠消耗量（mol），M0为样品质量（g），198为海藻酸钠单元分子量（g/mol）。

1.2.2 体外循环PVC管路表面涂层物的固定

1.2.2.1 体外循环PVC管路表面预处理及修饰

取内表面积为50 cm2的普通PVC管，放入预配好的高锰酸钾浓硫酸溶液，酸化处理5 min；蒸馏水冲洗经酸化处理后的PVC管；将酸化处理后的PVC管放入不同浓度聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI）溶液中，pH调到9，常温下进行氨基化修饰，修饰时间20 min；蒸馏水充分冲洗，获得不同PEI浓度条件下制备出的氨基化修饰的PVC管。

1.2.2.2 OSA涂层物的终点固定

配制不同浓度的 OSA溶液500 mL，将 OSA溶液pH调到不同值，并将OSA溶液倒入表面修饰后的PVC管路中，两端封闭，在不同温度下水浴2 h。最终制备出不同条件下OSA涂层的PVC管路。

1.2.3 OSA涂层物密度测定

按文献［10］方法建立多糖定量标准曲线方程。取OSA涂层管路反应后溶液2 mL加入1 mL苯酚，再迅速加入5 mL浓硫酸，沸水浴15 min，然后取出容量瓶自然冷却，取反应液在630 nm处测吸光度值，将反应前后吸光度值代入多糖定量标准曲线方程，算出反应前后OSA浓度差值，并计算涂层管路内表面OSA涂层密度。

涂层密度 =（反应前浓度-反应后浓度）×

1.2.4 OSA涂层最佳条件筛选

1.2.4.1 OSA最佳氧化度的筛选

在其他反应条件不变的情况下，选用高碘酸钠和海藻酸钠摩尔比为1∶8、1∶10和1∶12制备的 OSA进行涂层，并分别编号为PVCSH、PVCSM和PVCSL组。计算3组涂层密度并进行比较，以期获得涂层效果最佳的氧化度。

1.2.4.2 OSA涂层PVC管路最佳条件的筛选

利用正交设计的方法，将酸的浓度、PEI浓度、OSA溶液浓度、OSA溶液pH值和温度作为5种因素，每种因素3个水平：酸的浓度分别为40％、50％和70％；PEI浓度分别为 0.05、0.1和0.5 mg/mL；OSA溶液浓度分别为0.1、0.5和2 mg/mL；pH值分别为3.5、6和9；温度分别为30℃、40℃和50℃；通过SPSS17.0生成正交表；按生成的正交表设计实验，并重复3次，采用硫酸-苯酚法定量涂层的密度，并进行统计学分析，筛选最佳涂层条件。

1.2.5 涂层表面血液凝固时间测定

评价指标包括部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间测定（TT）和FT（纤维蛋白原时间）。方法为剪10 cm2的样管，置于24孔板中并用生理盐水常温下浸泡1 h；取健康自愿者血液，在3 500 r/min条件下离心15 min，得到贫血小板血浆（PPP），测定孵育前 PPP凝血4项值；吸净24孔板中生理盐水，加入 PPP 750 μL，置于37℃水浴箱内孵育1 h，抽取孵育后的血浆，测定反应后凝血4项的值。

1.2.6 涂层表面蛋白吸附实验

按试剂盒方法建立BCA法蛋白粘附的标准曲线。测定各组人血清白蛋白和纤维蛋白粘附量并进行对比分析。

依照文献［11］的方法，配制200 μg/mL的蛋白工作液，然后将10 cm2的样管加入到24孔板中，加入蛋白工作液1.5 mL，37 ℃下反应1 h，取100 μL待测反应液加1 mL BCA工作液，迅速混匀，60℃水浴30 min后于562 nm处测吸光度值，由标准曲线计算反应前后蛋白浓度差值，得到蛋白粘附密度。

1.2.7 涂层表面血小板粘附评价

依照文献［12］，取健康志愿者血浆，将新鲜血浆在800 r/min条件下，离心10 min，取上层血浆，得到富血小板血浆（PRP），测定反应前PRP血小板值PLT1；剪10 cm2的样管，置于 24孔板中，加入 PRP 500 μL，于37 ℃ 孵育1 h，取出孵育后的 PRP，并测定血小板值 PLT2，然后计算反应前后血小板的差值。

1.2.8 表面血栓形成实验

按文献［13］的方法，将10 cm2的样管冲洗3次后放于24孔板中，真空干燥并称重编号W1，取健康志愿者新鲜全血1.5 mL加入到24孔板中，在37℃下孵育30 min，取出样管，PBS冲洗3次，冲去表面粘附不牢固的血栓，真空干燥，称重W2，计算反应前后的差值。

血栓粘附量（mg）=W1-W2（6）

1.2.9 PVCS和PVCM脱落率测定

将制备好的长为1 m的PVCS管路连接到ECMO上，流量控制为2.4 L/min，转流72 h，分别在 0.5、1、2、4、8、12、24、48、72 h，取转流液体，用硫酸苯酚法测得转流液中OSA浓度，并计算相对应时间的PVCS中OSA脱落率，，并重复3次。同时用同样的方法将PVCM连接到ECMO上，同样的条件转流72 h，并在相同的时间点取转流液，用甲苯胺蓝法测转流液中肝素浓度，并计算PVCM中肝素脱落率。

1.2.10 统计学方法检验

所有数据以均数±标准差（¯x±s）表示，结果采用SPSS17.0软件包进行分析，组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD检验，统计学差异检验标准P ＜0.05。

2 结果

2.1 海藻酸钠氧化度标准曲线

2.1.1 海藻酸钠氧化度标准曲线建立

根据上述标准曲线的建立方法，计算得海藻酸钠氧化度标准曲线：

2.1.2 海藻酸钠氧化度

由图1可见，随着高碘酸钠摩尔比例的增加，氧化度逐渐增加，梁晔等报道，当海藻酸钠氧化度较高（47％）时，大剂量的OSA对细胞表现出较明显的抑制作用，且随着氧化度的增加，细胞毒性也随着增加；但中等氧化度（24％）和低氧化度的OSA就表现出良好的生物相容性，细胞毒性较低，对细胞生长无明显抑制作用［14］，与Gao等报道的氧化度小于30％的时候，具有非细胞毒性结果［15］相一致，故采用低氧化度的OSA作为反应原料。

2.2 多糖定量标准曲线建立

根据标准曲线建立方法，得多糖定量标准曲线方程：

图1 海藻酸钠24 h氧化度Fig.1 The 24 hours oxidation degree of sodium alginate

2.3 最佳涂层条件筛选

2.3.1 OSA最佳氧化度的筛选

各级各有关部门始终把人民群众的生命安全放在首位，及时发布洪水预警，全面排查危险地区群众，提前转移受洪水威胁人员，有效保障了群众生命安全。灾区各级政府多方筹集资金，加大安置和救济工作力度，保障了受灾群众基本生活。针对房屋损毁多、洪水时间长的实际困难，黑龙江省强化受灾群众集中安置与投亲靠友安置，全力推进房屋修缮重建，确保群众安全温暖过冬，帮助群众尽快返迁。由于“以人为本”始终贯穿于各个工作环节，大江大河洪水未造成一人死亡，灾区社会和谐稳定。

计算3种氧化度OSA的涂层密度，结果如表1。PVCSM和PVCSL组相比，前者OSA涂层密度显著大于后者（P=0.019）；PVCSM与PVCSH组相比，前者OSA涂层密度显著大于后者（P=0.029）；PVCSL和PVCSH组相比，OSA涂层密度无显著差异（P=0.926）；故本实验采用氧化度为9.65％的OSA作为涂层材料。

表1 不同组涂层密度Tab.1 The coating density of different groups

2.3.2 OSA涂层PVC管路最佳条件的筛选

重复5因素3水平正交试验3次，结果如表2所示。根据分析结果结合试验条件筛选出最佳涂层条件为50％的浓硫酸、0.05％的PEI、反应溶液pH3.5、反应温度为50℃和OSA浓度为2 mg/mL，测试管路涂层效果、血液相容性和生物相容性均以最优条件涂层的管路作为样品。

表2 正交实验中各组涂层密度Tab.2 The coating density of different groupsin the orthogonal table

2.4 涂层表面凝血功能

各组反应后凝血4项的值见表3。PVCS组PT和APTT延长时间均显著长于PVCC组（P＜0.05），但均劣于PVCM组（P＜0.05）；PVCS组TT和FT延长时间均显著长于PVCC组（P＜0.05）和PVCM组（P＜0.05）。如图2所示。提示PVCS组有良好的抗凝效果。

表3 不同分组的涂层管路抗凝血结果Tab.3 The anticoagulant results of different groups

图2 各组抗凝血指标柱形图Fig.2 The anticoagulant indicators of different groups

2.5 涂层表面蛋白吸附

2.5.1 蛋白粘附的标准曲线

根据标准曲线制定方法，制定蛋白吸附标准曲线方程：

2.5.2 涂层表面蛋白粘附量

计算蛋白粘附量得表4，结果提示PVCS组人血清白蛋白粘附量显著少于 PVCC组（P=0.000）和PVCM组（P=0.002）。PVCM组人血清白蛋白粘附量显著少于PVCC组（P=0.002）。纤维蛋白粘附试验与人血清白蛋白粘附试验结果相似，PVCS组纤维蛋白粘附量显著少于PVCC组（P=0.000）和PVCM组（P=0.029）；PVCM组纤维蛋白粘附量显著少于PVCC组（P=0.000）。涂层表面蛋白粘附量结果表明PVCS组具有良好的生物相容性。

2.6 涂层表面血小板粘附

表5结果提示PVCS与PVCC组相比，血小板粘附量显著减少（P＜0.05）；PVCS与PVCM相比，无显著差异（P＞0.05）；PVCM组与PVCC组相比，血小板粘附量显著减少（P＜0.05）。提示PVCS和PVCM能够减少血小板的粘附，此结果可以在电镜下得到佐证，见图 3。

表4 不同组蛋白吸附量Tab.4 The protein adhesion amount of different groups

表5 不同组的血小板粘附结果Tab.5 The platelet adhesion results of different groups

由图3（a）可以看出，PVCC组管路表面均粘附了较多的血小板及其碎片，并有血小板出现形态学的改变；而在PVCS组（图3（b））和 PVCM 组（图3（c）），电镜下血小板粘附量明显减少。提示PVCS组和PVCM具有良好的抗血小板粘附的能力。

2.7 涂层表面血栓形成

计算血栓形成实验前后干重差值，如表6所示，提示PVCS组与PVCC组相比，血栓形成显著减少（P＜0.05），PVCS组与PVCM组相比，无显著差异（P＞0.05）。PVCM与PVCC组相比，血栓显著减少（P＜0.05）。提示PVCS和PVCM组都能有效的减少血栓形成，都具有良好的血液相容性。

2.8 PVCS和PVCM脱落率

通过计算得到，PVCM 组在 0.5、1、2、4、8、12、24、48、72 h时间点上的脱落率均值，依次为0.08％、0.22％、0.53％、0.86％、1.23％、1.32％、1.33％、1.33％和1.34％，可见随着时间的延长PVCM中肝素缓慢脱落到8 h的时间点基本趋于稳定。而PVCS组在相同时间点上的脱落率均值分别为0.22％、0.52％、0.83％、1.26％、2.73％、3.2％、3.4％、3.5％和3.5％；由上可见，PVCS中OSA脱落率较PVCM中肝素脱落率稍高，但与PVCM有着相同的脱落趋势。OSA涂层物脱落在第12 h趋于稳定，能够满足短期体外循环的要求，结果如图4所示。

图3 不同分组电镜下血小板粘附（5 000×）。（a）PVCC；（b）PVCS；（c）PVCMFig.3 The platelet adhesion of different groups under the electron microscopy（5 000 ×）.（a）PVCC；（b）PVCS；（c）PVCM

表6 血栓形成密度Tab.6 The density of thrombosis

3 讨论和结论

本研究应用低氧化度的OSA作为涂层材料，通过最佳涂层条件的筛选试验证明，OSA涂层物能够固定在PVC管路表面。

图4 PVCS和PVCM脱落率Fig.4 The expulsion rate of PVCS and PVCM

凝血功能试验，PT反映外源性凝血系统，APTT反应内源性凝血系统，PVCS组PT和APTT时间均显著延长，显示了良好的抑制内源性和外源性凝血系统的效果，TT和FT均反映凝血系统的白血栓的形成，PVCS组TT和FT时间均显著延长，说明PVCS组能够抑制血栓的形成，这与Andersson［16］等报道相一致。

蛋白粘附试验结果表明，PVCS组抗蛋白粘附的效果优于PVCM，体现了PVCS优越的生物相容性，这也提示PVCS组能够弥补肝素生物相容性稍差的不足。

血小板粘附试验结果提示PVCS与PVCM均具有良好的抗血小板粘附的作用，体现了两组管路良好的血液相容性，这个试验结果与Manju等研究结果［17］相吻合。血栓形成试验也证明PVCS组具有减少血栓形成的作用。

尽管PVCS组脱落率稍高于于PVCM组，但是完全能够满足短期的体外循环支持的心外手术。若PVCS组管路代替心外手术体外循环应用的未涂层PVC管路，理论上可以起到减少血栓形成、降低肝素化的肝素用量、减少炎症反应和降低并发症发生率的效果。此外，由于PVCS组制作成本较低，原材料获取容易，适合临床大范围推广甚至是常规应用，为短期体外循环用管路提供了一个良好的思路。

本研究结果定量试验显示PVCS组上有效的固定了OSA，而且其72 h内的脱落率在3.5％左右，虽然稍高于PVCM组中肝素的脱落率，但是仍保持较低水平，显示了较好的稳定性。血液相容性试验显示出PVCS组管路能够起到良好的抗凝和减少血栓形成的效果，但是其性能与PVCM组相比稍差。生物相容性试验显示出PVCS组管路能够有效的减少人血清白蛋白和纤维蛋白的粘附，且其性能优于PVCM组。综合看PVCS组管路具有较好的稳定性、优越的生物相容性和较好的血液相容性，为体外循环用涂层管路，提供一个价格较为低廉的新的涂层材料。

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