Cyt－C Bcl－XL和Bcl－XS在大鼠创伤性脑损伤模型中的表达意义

宋 宇 魏志玄（通讯作者）

南阳医专第一附属医院神经外科 南阳 473000

Cyt C、Bcl－XL和Bcl－XS在外伤性会出现神经元中表达变化，在不同模型中，由于存在许多影响因素，表达变化的规律也不尽相同。受伤后，脑的不同部位神经元Cyt C、Bcl－XL和Bcl－XS表达随损伤后不同时间亦呈现一定的变化规律［1］。本文对创伤性脑损伤后海马CA2、CA3区Cyt－C表达与Bcl－XL和Bcl－XS表达进行研究，揭示脑损伤后不同时间其变化规律，为脑创伤临床研究提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂：甲苯胺蓝（南阳医专一附院病理中心实验室提供）、Bcl－XL和Bcl－XS原位杂交检测试剂盒 （武汉博士德生物生物工程有限公司）、细胞色素C检测试剂盒（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）、链霉素抗生物素蛋白－过氧化物酶免疫组化染色试剂盒（SP）（天津灏洋生物制品科技有限公司）、多聚赖氨酸（天津灏洋生物制品科技有限公司）、DAB显色液（天津灏洋生物制品科技有限公司）

1.1.2 主要仪器设备：DH－140型动物人工呼吸机（浙江医科大学医学仪器实验厂）、改良Feeney自由落体打击装置、Olympus光学显微镜（日本）、Motic病理图像分析系统：（北京航空航天大学）、HH－s恒温水浴箱（金坛市医疗仪器厂）、隔水式电热恒温箱（湖北省黄石市医疗仪器厂）、PIKA切片机（日本）、免疫组化湿盒、染色缸、微量移液器。

1.2 实验动物 健康雄性SD大鼠60只，体质量300～350 g，采取自然光照，自由进食喂养，喂养1周后制作颅脑损伤动物模型。

2 实验方法

2.1 实验动物分组 实验动物随机分成2h、6h、12h、24 h、72h、120h、168h9个时相组和正常组，每组5只大鼠。

2.2 大鼠脑挫裂伤模型处理方法 按照改良Feeney自由落体脑损伤模型方式制作大鼠左顶叶脑挫裂伤模型。损伤装置由底板、固定支架、垂直导引杆、下落击锤和撞击圆锥组成。导杆84.3g，击锤23.1g，撞击圆锥头端直径4mm，高2.5mm。以10%水合氯醛按照350mg／kg腹腔内注射麻醉大鼠后，将其头部固定，剪去顶部皮毛，消毒皮肤后，沿中线左侧矢状切开头皮，剥离骨膜显露左顶颅骨，于中线左侧旁开约2mm，前囟后约2mm处用牙科钻开一直径5mm圆形骨窗，保持硬膜完整。以40g砝码于25cm高处通过金属导杆落下，撞击置于硬脑膜上的圆锥致重型脑挫裂伤，用骨蜡封闭骨窗，缝合头皮，置鼠笼喂养。实验过程中用维持大鼠肛温36.5～37.5℃，直至苏醒。

2.3 标本采集及制备 各时相点在10%水合氯醛深度麻醉状态下开胸，穿刺左心室，经心用1%肝素生理盐水，直至回流液清亮，再缓慢灌注4%多聚甲醛溶液，大鼠开始出现全身肌肉抽动、四肢僵直表明灌注成功。断头并取脑组织标本，置于10%中性甲醛于后固定24h。取出固定液中的脑组织标本，冠状位切取前囟后3.3～4.3mm脑组织，常规脱水、透明、石蜡包埋。冠状面连续切片，厚度约5μm，以经粘片剂处理过的载玻片捞片，晾干后置于60℃烤箱烘烤4h。Cyt－C免疫组化检测法（SP法）和Bcl－XL和Bcl－XS原位杂交检测参考Jiang等［2］的方法。

2.4 计数方法 本实验所采用的打击方案中，受力的中心部位在大鼠海马CA2－CA3区（包括CA2与CA3交界部），故该区变化最为明显。所以我们选取此部位进行观察，在Motic病理图象分析系统下，随机计数大鼠海马CA2－CA3区0.01mm2中细胞色素C阳性细胞数及凋亡细胞数并测量细胞色素C阳性细胞积分光密度值、凋亡细胞平均灰度值，以此间接反映其相对含量。

2.5 统计学方法 实验中所得数据以Excel数据库整理后用SPSS 11.0统计软件包进行t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 Cyt－C免疫组化结果 Cyt－C免疫组化显示，大鼠脑挫裂伤后2h海马CA2－CA3区已出现Cyt－C阳性神经元的表达，显微镜下阳性细胞胞浆着棕黄色，伤后2hCyt－C阳性神经元的数量逐渐增加，6h达到高峰，伤后12hCyt－C阳性神经元的数量明显下降，到伤后24、48、72、120、168hCyt－C的表达基本消失。Cyt－C阳性细胞主要位于海马CA2－CA3区及齿状回，正常组海马区几乎未见Cyt－C表达阳性神经元（P＜0.05）。

图1 创伤后Cyt－C阳性神经元的变化趋势

3.2 Bcl－XL和 Bcl－XS原位杂交结果 Bcl－XL和 Bcl－XS原位杂交结果显示，大鼠脑挫裂伤后2h海马CA2－CA3区Bcl－XL已开始减少，伤后24h下降明显，48h已逐渐平稳；Bcl－XS于伤后24h开始增加，到伤后72h达峰值；Bcl－XL和Bcl－XS的比值随手损伤的时间的延长而逐渐下降，各个时点的比值均＜1（P＜0.05）。

图2 创伤后Bcl－XL和Bcl－XS的比值变化趋势

4 讨论

Bcl－2基因家族在细胞凋亡中起调节作用，它包括两个基因，一个抑制细胞凋亡如 Bcl－2、Bcl－XL、Bcl－W，另一个促进细胞凋亡如 Bax、Bak、Bcl－XS［3］。Bcl－2 抑制caspase－9的激活是通过阻止Cyt－C由线粒体释放，防止Cyt－C与Apaf－1结合而实现。Cyt－C是电子传递链的重要组分它通过与胞浆因子 Apaf－1及caspase－9等结合成“凋亡诱导复合物”使caspase－9自催化激活，进而激活caspase－3等而促进细胞凋亡。Cyt－C由线粒体向细胞质释放是caspase－3激活的必要条件，caspase－3是caspase家族最重要的凋亡执行者，凋亡执行阶段负责对全部或部分关键性蛋白的酶切。Bcl－XL与Bcl－XS调节细胞的凋亡，不仅取决于自身表达的高低，还与Bcl－XL与 Bcl－XS比值有关。Bcl－XL与 Bcl－XS比值决定细胞对各种引起凋亡刺激的敏感性，当比值增大时，细胞趋于凋亡［4］。

细胞色素C（Cytochrome C，Cyt－C）是一个定位于线粒体膜间隙的相对分子质量为15kD的水溶性蛋白质，是在呼吸链中电子传递必需的一类色素蛋白，其色素辅基是含铁的卟啉衍生物。正常情况下Cyt－C电稳定性地结合于线粒体内膜，不能通过外膜。Cyt－C缺乏时，电子传递链被阻断，将导致两方面的后果：ATP合成减少及不完全氧化造成的超氧阴离子（ROS）过度生成，而ROS是诱导凋亡的重要因素。在凋亡过程中起重要作用的不只是线粒体呼吸活性的丧失，更重要的是线粒体内外膜间的Cyt－C移位至胞质，在ATP／dATP的参与下，与 Apaf－1（apoptotic protease activating factors）结合形成寡聚体（apoptosome），在 Apaf－1介导下，Cyt－C首先使procaspase－9裂解产生活化的caspase－9，活化的caspase－9再使procaspase－3裂解产生活化的caspase－3，活化的caspase－3使具有DEVD序列的聚（腺苷二磷酸核糖）聚合酶（PARP）前体裂解产生有活性的PARP后者在细胞凋亡的后续事件中起重要。caspase－3是caspase家族最重要的凋亡执行者之一，在凋亡的执行阶段，负责对全部或部分关键性蛋白的酶切作用（激活或灭活）。Cyt－C自线粒体的释放在激活caspase、诱导细胞凋亡方面具有重要意义。Sulliven等［5］用Western Blot法研究脑损伤后神经元Cyt－C的释放情况，发现伤后神经元胞浆中Cyt－C释放具有明显的时相性，而线粒体中Cyt－C的含量则随时间变化而不断下降。

虽然大量的临床和动物实验都证明了创伤性脑损伤后神经细胞凋亡的出现，但是关于脑损伤后神经细胞凋亡的确切机制尚未完全明确。本课题按照改良Feeney自由落体脑损伤模型方式制作左顶叶重型脑挫裂伤模型，通过采用免疫组化对大鼠脑挫裂伤后Cyt－C释放、神经细胞凋亡情况进行检测，结果显示，在直接损伤部位存在着神经元细胞的坏死，但在损伤周围区域及海马CA2－CA3区则发现了Cyt－C阳性神经元的释放，而且Cyt－C释放、凋亡具有明显的时相性。脑损伤后1h海马CA2－CA3区即出现Cyt－C阳性染色的神经细胞，Cyt－C主要表达于神经元胞浆内，于6h达高峰，12h后开始减少，这与相关文献报道大致相同。脑挫裂伤早期，海马CA2－CA3区出现Cyt－C阳性染色的神经细胞，Cyt－C主要表达于神经元胞浆内，可能是创伤后线粒体结构被破坏，电子传递链被阻断，线粒体膜通透性的改变，导致呼吸链与氧化磷酸化失偶联，ATP合成减少，线粒体基质Ca2＋外流，还原性谷胱甘肽和NAD（P）H2减少，不完全氧化造成的超氧阴离子增加。有报道认为创伤性脑损伤后Cyt－C的释放部分是氧自由基依赖性的。一方面线粒体的损伤导致了这些物质的释放，另一方面这些物质的释放又加重了线粒体的损伤，这样使得定位于线粒体内膜的Cyt－C释放入胞浆，Cyt－C自线粒体的释放激活了caspase，活化的caspase自身也可以刺激线粒体释放Cyt－C，有研究发现活化的部分caspase与分离出的线粒体作用，能改变线粒体膜的通透性，导致内膜跨膜电位的丧失。这样就有可能存在一个caspase和线粒体自身反馈的环。大量氧自由基的形成加重了线粒体的损伤，如此反复，也形成一个自身反馈的环。以往和目前的研究［6］表明，脑外伤后给予氧自由基清除剂能明显减轻损伤，据此认为胞浆内的氧自由基可能通过开放膜通透转运孔或者损害线粒体膜的完整性，导致了Cyt－C的释放。脑挫裂伤中期，线粒体破坏严重，Cyt－C释放达高峰，Cyt－C可作为脑损伤早期诊断和损伤时间推断提供一项辅助诊断依据。

［1］Busto R.Small difference in intraischemic brain temperature critically determine the extent of ischemic neuronal injury［J］.Cereb Blood Flow Metab，1987，7（6）：729－738.

［2］Jiang JY，Lyeth BG，Clifton GL，et al.Relationship between body and brain temperature in traumatically brain－injured rodents［J］.Neurosurgery，1991，74（3）：492－496.

［3］Xu L，Yenari MA，Steinberg GK.Mild hypothermia reduces apoptosis of mouseneurons in vitro early in the cascade［J］.Cereb Blood Flow Metab，2002，22（1）：21－28.

［4］Edwards AD，Yue X，Squire MV，et al.Specific inhibition of apoptosis after cerebral hypoxia－ischemia by moderate post－insult hypothermia［J］.Biochem Biophys Res Commun，1995，217（3）：1 193－1 199.

［5］Sullivan PG，Keller JN，Bussen WL，et al.Cytochrome Crelease and caspase activation after traumatic brain injury［J］.Brain Research，2002，949（1－2）：88－96.

［6］Luetjens CM，Bui NT，Sengpie LB.Delayed mitochondrial dysfunction in excitotoxic neuron death：Cytochrome C release and a secondary increase in superoxide production［J］.Neuroscience，2000，20（15）：5 715.