不同电刺激对卒中后大鼠神经前体细胞增殖的影响

马明明 王雪晶 方燕南 李 玮 张杰文

1）河南省人民医院神经内科 郑州 450003 2）郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052 3）中山大学第一附属医院神经内科 广州 510080

脑卒中是严重危害人类健康的常见疾病，具有高发病率、高病死率及高致残率的特点，给患者家庭及社会带来沉重负担，而缺血性卒中是脑卒中的主要类型，约占所有卒中的75%［1］。如何迅速缺血损伤后神经系统的功能，成为目前神经科学研究的热点问题。电针是治疗脑梗死的重要方法之一，既往研究认为电针治疗促进康复治疗的机制是促使神经前体细胞的增殖和迁移。但对头皮电针刺激和肢体电针刺激的有效性，国内外至今未见报道。

为探讨肢体电针刺激和头皮电针刺激对急性缺血性脑卒中后神经系统功能和神经干细胞增殖的影响，本研究选取SD大鼠成功建立电凝法大脑中动脉闭塞模型，在术后24h开始分别用头皮电针刺激和肢体电针刺激的方法对脑梗死后大鼠开始治疗。在梗死后7d、14d、21d时以横木行走试验进行神经功能评分，同时对室管膜下区进行BrdU的免疫组化染色。观察不同部位电针刺激对卒中后大鼠神经功能和神经前体细胞增殖的影响，为脑梗死的康复治疗提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：本实验采用的二级SD大鼠由广东省医用实验动物中心和中山大学实验动物中心提供，雄性，2～3月龄，符合国家卫生部颁发的实验动物清洁级标准。实验期间所用动物饲养于中山医科大学第一附属医院动物实验中心，饲养条件为清洁级，5～10只／笼，任意供水，鼠粮用饲水浸软后喂给，饮用自来水，动物房温度控制在20℃左右，光暗周期24 h。实验动物用完全随机法分组。

1.1.2 仪器和试剂：双极眼科电凝镊／GD350－S型电凝器由上海泸通电子有限公司生产；JD－9605型电脑针灸治疗仪由上海晋电成套设备有限公司生产；SDR－I型大鼠心率血压计由中日友好医院研制 ；全自动脱水机、石蜡包埋机、石蜡包埋机、石蜡切片机均由德国Leica公司生产；日本产Olympus光学显微镜和德国产ZEISS Axiotron研究型显微镜。TTC（triphenyltetrazolium chloride，氯化三苯四唑）染色试剂和Brdu抗体均购自北京中山生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和模型建立：选用2～3月龄，体质量80～120g雄性SD大鼠95只。85只大鼠按我们已建立的方法复制RHRSP模型。另10只大鼠作RHRSP模型假手术对照，只打开腹腔，不进行双侧肾动脉夹闭术。肾动脉狭窄术12周内死亡3只，剔除2只血压低于24kPa（180mmHg）、5只有卒中症状和体征者，取血压＞24kPa且无脑卒中症状，体质量450～500g的RHRSP 75只，采用 Wahl等［2］的方法加以改良制作MCAO模型。

63只用于MCAO模型制作，余下的12只行假手术（相同的开颅术，但不凝闭 MCA主干）。63只鼠中成功制成MCAO模型者54只，另9只鼠因MCAOMCAO后出血多或手术显微镜下未明确供血是否中断视为不成功未入组。54只MCAO鼠随机分为梗死灶周围电刺激组（A组）肢体电刺激组（B组）和对照组（C组）各18只，A和B组在MCAO后24h开始进行电刺激治疗，C组和假手术组（D组）不进行治疗。每组根据电刺激治疗时间不同于MCAO后1d、2d（电刺激后1d）、7d、14d、21d、28d各3只取脑检测各项指标。1.2.2 电刺激治疗方法：MCAO后24h，行电刺激治疗的2组大鼠（A组、B组）用JD9605型电脑针灸治疗仪（上海产）行电刺激，不同的刺激组选择不同的穴位进行干预治疗。①A组选择梗死灶周围头皮进行电刺激治疗，1次／d。频率75次／min，电流1～2mA，20min／次。1d实验组大鼠治疗24 h后，于次日处死待查。1周实验组治疗6次后，于次日处死待查。2周、3周、4周实验组大鼠6d治疗1个疗程，停1d进行下个疗程治疗，每个疗程结束后次日处死。②B组选穴为病灶对侧相当于人的“曲池”、“外关”、“太冲”及“足三里”，上述同样强度和时间的电刺激干预治疗。③C组大鼠和D组大鼠不进行电刺激治疗。

1.2.3 大鼠肢体功能评分：参照Feeney运动功能评分方法［3］，各组大鼠在大脑中动脉闭塞（MCAO）术前及 MCAO后第1周、第2周、第3周、第4周进行横木行走试验检查，以判断肢体功能恢复的程度。

1.2.4 HE染色和分子病理检测：每组大鼠在不同的时间点上处死后，每个时间点上每组大鼠取2只立即断头取脑，剥离血管和硬脑膜后，观察梗死灶外观。置于2%TTC溶液中，37℃避光恒温箱孵育30min，取出脑，放在－20℃冰箱10 min。待脑组织稍硬后，使用锋利刀片，由脑的前极向后极，冠状切片，片厚约2mm，再置于2%的TTC溶液中，37℃避光温育30min，然后转移至用PBS配置的4%的多聚甲醛中固定。使用Leica脱水机连续脱水17.5h，常规石蜡包埋，冠状连续切片（5μm厚），按我室常规方法，进行HE染色。观察缺血中心与缺血周边区的脑缺血损伤的组织特点。同时选连续切片进行Brdu的免疫组化染色。免疫组化染色按试剂盒（北京中山生物技术有限公司）提供的染色步骤进行。

1.2.5 染色结果分析和统计学处理：采用显微镜下计数的方法对免疫组化的阳性进行计数，每个时相点4只动物，以皮层、海马DG和SVZ为观察部位，每只动物每个部位各取切片10张，其中每相邻两张切片分别行Brdu和Nestin免疫组化染色，切片在统一放大倍数（10×20）下，随机选择10个视野，在生物系统显微镜（日本，OLYMPUS BX51型）下，数出每个视野的阳性细胞后计算每只鼠所要分析部位的平均阳性细胞数。

1.3 统计学处理 本研究所得结果以BZ_15_1694_320_1782_360表示，全部数据均采用SPSS 13.0统计学软件进行分析，选用单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术后大鼠肢体功能评分 见表1。

表1 不同时期MCAO大鼠神经功能评分比较 （BZ_15_1694_320_1782_360）

按照Feeney运动功能评分方法。假手术组无运动功能缺损，评分均为7分（正常）。如表1所示，电刺激刺激前A组、B组及C组3组间评分差异无统计学意义（P＞0.05）。电刺激后第1周，A组分别与B组、C组比较差异有统计学意义（P＜0.05），而B组与C组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。电刺激治疗后第2周，A组与B组相比差异有统计学意义（P＜0.05），两者分别与C组相比差异均有统计学意义（P＜0.05），此时3组评分较刺激前差异有统计学意义（P＜0.05）。刺激后第3～4周A组与B组评分差异无统计学意义（P＞0.05），二者与C组（对照组）相比差异有统计学意义（P＜0.05）。组内比较，刺激后第1周开始，A组、B组、C组和刺激前相比差异均有统计学意义（P＜0.05），此种现象一直持续至第4周。

2.2 病理大体观察与HE染色 MCAO后1d，可见大鼠额、顶、颞叶肿胀，呈苍白色，左右大脑半球不对称，缺血侧水肿明显；MCAO后14d时在大脑中动脉供血范围内（以皮层为主）出现肉眼可见的坏死液化灶，坏死液化区随动物的不同而有差异。冠状切片HE染色可见皮质缺血区。HE染色切片上可见，缺血坏死灶并未累及侧脑室和海马，缺血区有炎症细胞浸润（包括中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞），组织水肿、疏松，细胞层次紊乱，缺血中心区出现坏死液化腔，但缺血14d后炎性改变逐渐消失。

2.3 室管膜和室管膜下区Brdu的表达 MCAO后1、2、7、14、21、28d所有缺血组（A组、B组、C组）与 D组比较，BrdU阳性细胞均显著增加（P＜0.05）。A组及B组缺血后室管膜Brdu表达与C组比较在7d、14d差异均有统计学意义（P＜0.05），MCAO后7d二者Brdu在室管膜和室管膜下区的表达相比差异有统计学意义（P＜0.05）；MCAO后21dA组Brdu的表达和C组比较差异有统计学意义（P＜0.05），但此时B组和C组差异无统计学意义（P＞0.05）；在 MCAO后1 d及28d三者Brdu均有表达但差异无统计学意义（P＞ 0.05）。

表2 4组不同时期Brdu在室管膜上皮和室管膜下区的表达情况 （）

表2 4组不同时期Brdu在室管膜上皮和室管膜下区的表达情况 （）

注：采用K－W 检验，与假手术相比，▼P＜0.05；与C组相比，△P＜0.05

组别 第1天 第2天 后第7天 第14天 第21天 第28天A组 13.10±1.18▼ 21.34±2.11▼ 77.42±3.64▼☆△ 46.82±5.32▼△ 28.42±4.96▼△ 18.32±3.52▼B组 13.21±1.85▼ 18.36±2.09▼ 45.24±2.65▼△ 36.21±8.43▼△ 19.15±5.39▼ 16.82±2.10▼C组 12.15±2.20▼ 14.65±1.67▼ 25.37±2.13▼ 18.44±4.45▼ 14.81±4.23▼ 14.46±3.62▼D组 7.85±1.05 7.34±1.08 6.35±1.35 6.20±2.15 7.75±1.45 8.01±1.15

3 讨论

功能电刺激在1960年已开始用于功能再训练［2］。1990年Jenkin等［3－4］证实：反复的周围神经刺激可以影响脑中枢系统，在功能恢复训练中，可按需从周围进行不同的刺激以达到影响脑中枢的目的。随着神经生物学、分子生物学的迅猛发展，有关针刺保护缺血性脑损伤调节机制的研究取得一定进展。神经前体细胞是指存在神经系统能够增殖分化为神经元、胶质细胞的神经干细胞。Brdu作为一种胸腺嘧啶脱氧核苷类似物，在细胞增殖周期的S期可嵌入细胞核DNA中，用免疫组化方法检测出来，因而Brdu阳性细胞可看作具有增殖活性的前体细胞。研究认为成年哺乳动物海马齿状回（DG）、SVZ存在神经前体细胞（NPCs），且终生具有增殖能力［5］。位于海马颗粒下层（SGZ）的NPCs发生增殖后，新生细胞移行至颗粒层（GCL），继续分化；起源于SVZ的神经前体细胞，通过嘴侧迁移流动到达嗅球（OB），也可进入邻近皮质分化为成熟神经元［6－7］。而缺血作为内源性增殖的强烈诱导因素可促使NPCs增殖、移行及分化［7］。既往研究证实电刺激能够明显促进神经前体细胞的增殖和迁移，但头皮电针刺激和肢体电针刺激孰优孰略，国内外未见文献报道。

本研究以电凝法成功制作大脑中动脉闭塞模型后观察发现，MCAO后1、2、7、14、21、28d缺血各组与 D组比较，BrdU阳性细胞均有显著增加（P＜0.05），28d时A组、B组与C组相比Brdu阳性细胞的表达差异均无统计学意义（P＞0.05）。这说明只要在缺血因素作用下，内源性神经干细胞会发生增殖，这种增殖在缺血后24h已经开始出现，从实验数据可以看出，在缺血第7天各缺血组的干细胞增殖（Brdu表达量）较术前明显增加，达到高峰；MCAO后14d神经干细胞的表达开始降低，MCAO后28d神经干细胞的表达和C组相比差异无统计学意义，这是因为28d时神经干细胞已经发生了分化，分化为神经胶质细胞和神经元，此时神经干细胞的水平接近术前状态，差异无统计学意义（P＞0.05）。与既往他人研究结果一致［8－11］。

本研究Brdu免疫组化发现，A组、B组和C组相比，梗死灶周围头皮电刺激治疗可促进手MCAO后7d、14d大脑皮质的细胞增殖（P＜0.05），手 MCAO后21d、28d梗死灶周围头皮电刺激治疗组大脑皮质无Brdu细胞增殖；肢体电刺激治疗组大脑皮质的Brdu阳性细胞在各个时间点与C组比较差异无统计学意义，在5个时间点上均无表达。两个治疗组对缺血7d、14d、21d后室管膜BrdU的表达与C组比较均有显著性差异，二者相比Brdu在室管膜和室管膜下区的表达有显著性差异；在MCAO后1d和28d三者间Brdu均有表达但无显著性差异。以上证明MCAO大鼠有无电刺激干预治疗均可促进神经干细胞增殖，但电刺激更易引起神经干细胞增殖，以梗死灶周围头皮电刺激治疗后神经干细胞的增殖明显。电刺激对缺血后神经干细胞的影响，我们认为主要与电刺激的以下几个作用有关［12－16］：（1）电刺激可促进脑内神经营养因子（NGF）的基因表达；（2）电刺激可增加脑缺血后脑源性神经营养因子（BDNF）及其受体TrkA的表达；（3）电刺激可促进脑缺血后脑内碱性成纤维生长因子（bFGF）的表达。而这些细胞因子都已经被证明与脑内神经发生关系密切。

综上所述，电刺激促进脑缺血后大鼠的肢体功能康复，神经症状学评分有明显改善，梗死灶周围头皮的电刺激治疗较肢体电刺激治疗改善程度好。电刺激促进MCAO后神经干细胞的增殖，但梗死灶周围头皮电刺激治疗较肢体电刺激治疗引起的神经干细胞增殖明显，二者相比差异有统计学意义。此研究可能为临床上脑梗死患者电刺激治疗的方案选择提供一定的理论依据。

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